Desenvolvimento de uma estratégia de fusão gênica visando à localização de proteínas em plantas

Abstract

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos.

A significant amount of plant proteins is compartmentalized in different cellular structures. The location of such proteins is essential to understand the function of biosynthetic and catabolic processes and also to help the identification of important genes. To identify the location of gene products related to resistance, rice (Oryza sativa) cDNAs were fused to a gene coding a GFP protein (green fluorescent protein). The cDNAs were obtained from a suppressive subtractive library of rice plants during an incompatible interaction with Magnaporthe grisea fungus. The cDNAs were fused to an enhanced version of gfp and they were used to transform 500 Arabidopsis thaliana plants, yielding 25.500 T1 seeds. Other 50 plants were transformed with the same vector, but without the EGFP::cDNA fusion (empty vector), yielding 35.000 T1 seeds. Seven hundred and fifty and 800 plants were generated from T1 seeds of the EGFP::cDNA fusions and empty vector transformations, respectively. Following herbicide selection, detached leaves were analyzed under a fluorescence microscope to evaluate the pattern of EGFP localization. It was observed that 18 plants transformed with EGFP:cDNA fusion and 16 plants transformed with empty vector showed detectable EGFP accumulation. One plant transformed with EGFP::cDNA showed a unique localization of the fluorescent signal. In this plant, the EGFP expression was predominantly visible at the stomata guard cells and trichomes. After, cDNA sequencing, the cDNA from this plant has shown insert similarity to kinase protein sequence, an enzyme class frequently related to signal transduction in response to pathogenic infections.