Isolamento e identificação de micro-organismos cultiváveis produtores de proteases provenientes da Antártida e caracterização da bactéria queratinolítica Lysobacter concretionis

Abstract

Na Península Antártica, uma grande concentração de aves nidifica anualmente; ainda assim, não é observado o acúmulo de penas no ambiente, sugerindo a ação da microbiota local. As queratinases são o grupo de enzimas capazes de degradar a queratina, identificadas majoritariamente em micro- organismos meso e termofílicos. O objetivo deste trabalho foi a identificação de bactérias queratinolíticas psicrofílicas ou psicrotolerantes, como uma nova alternativa para o uso de queratinases em processos industriais. Amostras de penas foram coletadas em pinguineiras na ilha Rei George, Antártida, o material semeado em meio ágar farinha de penas (AFP, 10 g L-1) e incubado entre 4 e 30 ºC. Seis isolados bacterianos capazes de crescer em AFP foram selecionados e inoculados em meio ágar leite, sendo que três deles formaram halos de proteólise entre 9 e 30 °C, preferencialmente em pH 9,0. Seu DNA foi extraído e o gene do rRNA 16S amplificado e sequenciado. Os isolados proteolíticos foram identificados como Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) e Chryseobacterium sp. (A17U). O sobrenadante de cultivo das três bactérias foi caracterizado ao longo de 7 dias de incubação em meio caldo farinha de penas (CFP, 10 g L-1), entre 20 °C e 40 °C sendo que todas apresentaram crescimento e produção enzimática ótimos a 20 °C, entre o 3° e o 4° dia. De acordo com os zimogramas, a linhagem A08 foi produtora de uma única protease, A17U de três e A03 de nove enzimas. Esta última se destacou por ser capaz de degradar o substrato farinha de penas quase completamente em 7 dias de cultivo e por tolerar concentrações relativamente altas de NaCl sendo, por isso, selecionada para a análise filogenética, na qual isolado foi identificado como Lysobacter concretionis, com um valor de bootstrap de 100%, e para a purificação por cromatografia de filtração em gel, Sistema Aquoso Bifásico (SAB) e Partição em Três Fases (TPP). O melhor resultado foi obtido na TPP, com a recuperação de 82% da atividade enzimática e um fator de purificação de 3,59 vezes, sendo possível a detecção de cinco bandas, de aproximadamente 70, 65, 50, 40 e 30 kDa no gel SDS-PAGE. Este é o primeiro trabalho que reporta uma grande capacidade queratinolítica pela linhagem psicrotolerante Lysobacter concretionis A03, sendo o seu emprego biotecnológico e industrial compatível com a redução de gastos energéticos para a degradação de resíduos queratinosos.

In the Antarctic Peninsula, high concentrations of birds nest every year; nevertheless, their feathers do not accumulate in the environment, suggesting the action of the local microbiota. Keratinases are the enzymes able to degrade keratin, identified mainly in thermophilic and mesophilic micro-organisms. The aim of this work was the identification of psychrophilic or psychrotolerant feather degrading bacteria, in order to reduce the energy consumption for the industrial application of keratinases. Penguin feathers samples were collected in King George Island, Antarctic, the material was spread in feather meal agar plates (FMA 1%) and incubated at 4 – 30 °C. Six isolates capable of growing on FMA were selected and incubated in skimmed milk agar; of these, three formed clear zones indicative of proteolytic activity, between 9 and 30°C, preferable at pH 9.0. Total DNA of isolates was extracted and the rRNA 16S gene was amplified and sequenced. Proteolytic isolates were identified as Lysobacter concretionis (A03), Arthrobacter sp. (A08) and Chryseobacterium sp. (A17U). The crude extract of the three bacteria was characterized along 7 days of cultivation at 20 to 40°C on feather meal broth (FMB, 1%). All bacterial strains showed medium alkalinization, optimum growing and enzymatic production at 20 °C, between third and fourth days, in despite of its optimal enzymatic activity on azocasein and azokeratin have been determined between 35 and 40°C. According to zymography, strain A08 produced only one protease, A17U three and A03 nine proteolytic enzymes, this later standing out due to their high feather meal degradation in 7 days of cultivation and by their tolerance to high salt concentrations, being, therefore, selected for Phylogenetic analysis, purification methods of gel filtration chromatography, aqueous two-phase partition (ATP) and three-phase partition (TPP). The isolate was identified by phylogeny as Lysobacter concretionis, with a bootstrap value of 100%. The best results in purification were achieved by TPP, despite has not been possible the isolation of a single protein, with recovery of 82% of enzymatic activity and a purification factor of 3.59. The SDS-PAGE showed the presence of five bands of approximately 70, 65, 50, 40 and 30 kDa. This is the first report of great keratinolytic ability by the psychrotolerant strain of Lysobacter concretionis A03, thus, its industrial use its compatible with the reduction of energetic costs for the degradation of keratin wastes by enzymatic digestion.