Perfil transcriptômico de células-tronco embrionárias humanas expostas a anticonvulsivantes e antidepressivos

Abstract

A taxa de uso de medicamentos durante a gestação no Brasil é estimada em 94%, sendo que muitos deles podem atravessar a placenta e entrar em contato com o embrião/feto em desenvolvimento. No entanto, poucos são considerados de risco, isto é, teratogênicos. Medicamentos neuro e psicotrópicos, por exemplo, podem exercer efeitos no embrião/feto, aumentando o risco de defeitos de tubo neural, anomalias cardíacas congênitas e transtornos do neurodesenvolvimento. Embora os mecanismos moleculares da teratogênese não sejam totalmente compreendidos, sabe-se que o impacto dos teratógenos está relacionado à desregulação de vias de sinalização essenciais ao desenvolvimento embrionário. Com o avanço da bioinformática e da biologia de sistemas, dados oriundos de experimentos com células- tronco embrionárias humanas em repositórios públicos tornaram-se valiosos para investigar os efeitos teratogênicos de fármacos. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar alterações na expressão gênica e na regulação transcricional induzidas por anticonvulsivantes e antidepressivos, utilizando dados ômicos públicos por meio de abordagens integrativas. Foram selecionados dados transcriptômicos de microarranjos e RNA-Seq do repositório Gene Expression Omnibus (GEO), considerando apenas experimentos in vitro com células-tronco embrionárias humanas. Excluíram-se estudos com menos de três amostras por grupo, ausência de dados brutos ou exposição simultânea a múltiplos fármacos. As amostras foram processadas conforme pipelines padrão. Dados de RNA- Seq foram analisados na plataforma Galaxy, e a expressão diferencial de genes (DGE) foi calculada no R com os pacotes limma (microarranjos) e edgeR (RNA-Seq). Genes com |logFC| ≥ 1 e p ajustado < 0,05 foram considerados significativos. A meta-análise foi conduzida com o pacote metavolcanoR, considerando genes com |meta-logFC| > 1 e FDR < 0,05. As análises de biologia de sistemas, voltadas à identificação de vias associadas a defeitos cardíacos congênitos, foram realizadas com o aplicativo PhenomeScape no Cytoscape, que detecta sub-redes gênicas diferencialmente expressas associadas a fenótipos. Além disso, duas abordagens de coexpressão gênica foram aplicadas em datasets de exposição ao Ácido Valpróico: uma hipótese livre com o pacote CEMiTool (considerando todos os genes), e uma hipótese dirigida com o diffcoexp (focando em genes previamente relacionados ao VPA). Foram analisados 15 datasets (GSE166297, GSE129241, GSE232218, GSE241903, GSE222509, GSE187006, GSE94521, GSE64123, GSE187001, GSE209962, GSE141253, GSE147270, GSE71127, GSE95791 e GSE233332), que incluíam exposições ao Ácido Valpróico (VPA) e a Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina (ISRS), como Escitalopram, Fluoxetina e Paroxetina. As metanálises revelaram 411 metagenes associados ao VPA e 181 aos ISRS. Observou-se superexpressão de genes como PRKCB, SCN1A e GABRB2 induzida por VPA em organoides cerebrais, corroborando estudos anteriores e sugerindo sua relevância nos mecanismos teratogênicos do VPA. Em relação aos ISRS, foi identificada a desregulação de genes ligados à cardiogênese (NKX2-3, EPAS1, BDNF, TPH2), a síndromes com anomalias cardíacas congênitas (EGFL8, TMEM238, RDH13, MAPT-IT1) e ao metabolismo do folato (MTHFD2 e ALDH1L2). As análises de biologia de sistemas indicaram que vias como Wnt canônica e as relacionadas à organização da matriz extracelular podem ter sua expressão alterada por ISRS, o que poderia impactar na ocorrência de defeitos cardíacos congênitos. A análise com o CEMiTool identificou 75 módulos de coexpressão em nove datasets, com enriquecimento de processos biológicos ligados ao desenvolvimento embrionário. Não foram encontrados genes hubs em comum entre os diferentes conjuntos. Já a análise com o diffcoexp focou em cinco grupos de ontologias: duas via GSEA (Significativas e Não Significativas), e três baseadas na literatura (Clássicas, Desenvolvimento Embrionário e Interesse Recente). Pares de genes foram considerados diferencialmente coexpressos se p.diffcor ≤ 0,05 e (cor.1 ≥ 0,7 ou cor.2 ≥ 0,7). Nos grupos Clássicas e Desenvolvimento Embrionário, destacaram-se os pares COL1A1-ASMTL e DDK1-CDH6, presentes em cinco datasets. Nos grupos Interesse Recente, Não Significativas e Significativas, os pares STAM-SOX2, RPL13A-PITX2 e JHY-CTNBB1 apareceram em seis datasets. Por fim, o teste de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar diferenças na quantidade de pares de genes diferencialmente coexpressos entre os grupos ontológicos, mas não foram observadas diferenças estatisticamente significativas.

The rate of medication use during pregnancy in Brazil is estimated at 94%, and many of these drugs can cross the placenta and reach the developing embryo/fetus. However, few are considered risky or teratogenic. Neuroactive and psychotropic medications, for instance, can impact the embryo/fetus, increasing the risk of neural tube defects, congenital heart anomalies, and neurodevelopmental disorders. Although the molecular mechanisms of teratogenesis are not fully understood, it is known that the impact of teratogens is related to the dysregulation of signaling pathways essential for embryonic development. With the advancement of bioinformatics and systems biology, data from experiments with human embryonic stem cells available in public repositories have become valuable for investigating the teratogenic effects of drugs. In this context, this study aimed to evaluate changes in gene expression and transcriptional regulation induced by anticonvulsants and antidepressants, using public omics data through integrative approaches. Transcriptomic data from microarray and RNA-Seq experiments were selected from the Gene Expression Omnibus (GEO), including only in vitro experiments with human embryonic stem cells. The studies with fewer than three samples per group, no raw data, or simultaneous exposure to multiple drugs were excluded. Samples were processed using standard pipelines. RNA-Seq data were analyzed on the Galaxy platform, and differential gene expression (DGE) was assessed in R using the limma package (microarrays) and edgeR (RNA-Seq). Genes with |logFC| ≥ 1 and adjusted p < 0.05 were considered significant. Meta-analysis was conducted with the metavolcanoR package, considering genes with |meta-logFC| > 1 and FDR < 0.05. Systems biology analyses aimed at identifying pathways associated with congenital heart defects were performed with the PhenomeScape app in Cytoscape, which detects differentially expressed gene subnetworks linked to specific phenotypes. In addition, two gene co- expression approaches were applied to datasets involving Valproic Acid (VPA) exposure: an unbiased analysis using the CEMiTool package (considering all genome-wide genes), and a hypothesis-driven analysis using the diffcoexp package (focused on genes previously linked to VPA). A total of 15 datasets were analyzed (GSE166297, GSE129241, GSE232218, GSE241903, GSE222509, GSE187006, GSE94521, GSE64123, GSE187001, GSE209962, GSE141253, GSE147270, GSE71127, GSE95791, and GSE233332), which included exposures to Valproic Acid (VPA) and Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRIs), such as Escitalopram, Fluoxetine, and Paroxetine. Meta-analyses revealed 411 metagenes associated with VPA and 181 with SSRIs. Overexpression of genes such as PRKCB, SCN1A, and GABRB2 was observed in brain organoids exposed to VPA, supporting previous findings and suggesting their relevance in VPA teratogenic mechanisms. Regarding SSRIs, dysregulation of genes related to cardiogenesis (NKX2-3, EPAS1, BDNF, TPH2), syndromes with congenital heart defects (EGFL8, TMEM238, RDH13, MAPT- IT1), and folate metabolism (MTHFD2 and ALDH1L2) was identified. Systems biology analyses indicated that pathways such as canonical Wnt and those involved in extracellular matrix organization may have their expression altered by SSRIs, potentially contributing to congenital heart defects. The CEMiTool analysis identified 75 co-expression modules across nine datasets, enriched for biological processes related to embryonic development. No common hub genes were found among datasets. The diffcoexp analysis focused on five ontology groups: two from GSEA analysis (Significant and Non-significant), and three based on literature (Classical, Embryonic Development, and Recent Interest). Gene pairs were considered differentially co-expressed if p.diffcor ≤ 0.05 and (cor.1 ≥ 0.7 or cor.2 ≥ 0.7). In the Classical and Embryonic Development groups, gene pairs such as COL1A1- ASMTL and DDK1-CDH6 stood out, appearing in five datasets. In the Recent Interest, Non- significant, and Significant groups, the pairs STAM-SOX2, RPL13A-PITX2, and JHY-CTNBB1 appeared in six datasets. Finally, the Mann-Whitney test was used to assess differences in the number of differentially co-expressed gene pairs among ontology groups, but no statistically significant differences were observed.