Fitocistatinas carboxi-estendidas em Arabidopsis thaliana : filogenia e caracterização molecular

Abstract

A regulação da atividade de proteases é crucial para o equilíbrio fisiológico das plantas durante o crescimento e desenvolvimento e as cistatinas, inibidores de proteases cisteínicas, desempenham um papel importante nessa regulação. As fitocistatinas são categorizadas como tipo I, proteínas pequenas de domínio único, tipo II, que possuem uma extensão C- terminal e são geralmente maiores, e tipo III, que são caracterizadas por múltiplos domínios cistatina. As fitocistatinas do tipo I e tipo III inibem proteases cisteínicas do tipo papaína (PLCPs), enquanto as fitocistatinas de tipo II podem inibir tanto PLCPs quanto enzimas de processamento vacuolar (VPEs). O presente estudo investiga fitocistatinas carboxi- estendidas através de análises filogenéticas, bem como caracterização molecular e estudos de interação proteica de CYSTATIN6 (CYS6) e CYSTATIN7 (CYS7) de Arabidopsis thaliana. Inicialmente, uma análise filogenética de cistatinas de plantas revelou uma estrutura gênica altamente conservada em Viridiplantae e que múltiplas duplicações gênicas, perdas e ganhos de íntrons contribuíram para a diversidade da família. Fitocistatinas do tipo I com íntrons compartilham similaridades de sequência com as do tipo II, sugerindo uma origem ancestral comum para ambos os tipos. Fitocistatinas do tipo I sem íntrons originaram- se de um evento único em plantas com flores. Quanto às fitocistatinas do tipo II, um evento de duplicação compartilhado por Rosidae resultou no surgimento de uma segunda cópia de fitocistatinas do tipo II em algumas espécies de plantas, incluindo Arabidopsis. Estes inibidores apresentam substituições de aminoácidos que podem modular interações com proteases alvo e outras proteínas. A duplicação dos genes de fitocistatina de tipo II em Rosídeas, incluindo Arabidopsis thaliana, motivou a investigação das diferenças funcionais entre CYSTATIN6 e CYSTATIN7. Dados de transcriptoma sugerem níveis de expressão e distribuição distintos para CYS6 e CYS7, bem como predições de localização subcelular distintas para as proteínas resultantes. Análises de microscopia confocal demonstraram a existência de duas proteoformas de CYS6 que se localizam em compartimentos subcelulares distintos: CYS6.1 no citosol e núcleo e CYS6.2 no retículo endoplasmático e vacúolo, indicando funções diversificadas para essencialmente a mesma proteína. Ensaios de pull- down identificaram novas proteases cisteínicas alvo para CYS6, bem como parceiros de interação não relatados, sugerindo seu envolvimento em múltiplas vias celulares. Quanto à CYS7, dados de microscopia confocal forneceram evidências de sua localização no vacúolo e no apoplasto. As linhagens superexpressoras e os esforços na produção de linhagens nocaute de CYS7 fornecem recursos valiosos para estudos adicionais para elucidar sua rede de interação e papéis biológicos. Os resultados, em conjunto, fornecem entendimentos sobre a evolução e função de fitocistatinas carboxi-estendidas em A. thaliana, enfatizando a complexidade de seus papéis e interações celulares.

The regulation of protease activity is critical for plant physiological balance during growth and development and cystatins, inhibitors of cysteine proteases, play an important role in that regulation. Phytocystatins are categorized into type I, which are small, single-domain proteins, type II, which possess a C-terminal extension and are generally larger, and type III, which are characterized by multiple domains. Type I and type III phytocystatins inhibit papain-like cysteine proteases (PLCPs), while type II phytocystatins can inhibit both PLCPs and vacuolar processing enzymes (VPEs). This study investigates carboxy-extended phytocystatins through phylogenetic analyses, as well as molecular characterization and protein interaction studies of CYSTATIN6 (CYS6) and CYSTATIN7 (CYS7) of Arabidopsis thaliana. Initially, a phylogenetic analysis of plant cystatins revealed a highly conserved gene structure across Viridiplantae and multiple gene duplications, intron losses, and gains contributed to the family diversity. Type I phytocystatins with introns share sequence similarities with type II, suggesting an ancestral common origin for both types. Intronless type I phytocystatins originated from a single event in flowering plants. As for type II phytocystatins, a duplication event shared by Rosids resulted in the emergence of a second copy of type II phytocystatins in some plant species, including Arabidopsis. These inhibitors with amino acid substitutions that may modulate interactions with target proteases and other proteins. The duplication of type II phytocystatin genes in Rosids, including Arabidopsis thaliana, motivated the investigation of the functional distinctions between CYSTATIN6 and CYSTATIN7. Transcriptome data suggests distinct expression levels and distribution for CYS6 and CYS7, as well as distinct predicted subcellular localization of the resulting proteins. Confocal microscopy demonstrated the existence of two proteoforms of CYS6 that localize to distinct subcellular compartments, CYS6.1 to the cytosol and nucleus and CYS6.2 to the ER and vacuole, indicating diversified functions for essentially the same protein. Pull down assays identified novel target cysteine proteases for CYS6, as well as unreported interaction partners suggesting its involvement in multiple cellular pathways. As for CYS7, confocal microscopy provided evidence for CYS7 localization to the vacuole and the apoplast. The overexpressing lines and the efforts into producing knockout lines of CYS7 provide valuable resources for further studies to elucidate its interaction network and biological roles. Collectively, these results provide insights into the evolution and function of carboxy-extended phytocystatins in A. thaliana, emphasizing the complexity of their roles and cellular interactions.