Potencial antifúngico dos compostos orgânicos voláteis produzidos por cepas Bacillus velezensis propostas como estratégia de biocontrole em uvas

Abstract

A contaminação fúngica é uma preocupação para a qualidade e produtividade de uvas, pois leva a perdas econômicas. Além disso, alguns fungos são capazes de produzir metabólitos secundários tóxicos, as micotoxinas. O uso de agrotóxicos sintéticos é amplamente difundido para o combate de fungos na viticultura, porém trazem preocupações devido aos danos ao meio ambiente e à saúde. Diante disso, a procura por novas alternativas para diminuir ou substituir agrotóxicos se tornam cada vez mais importantes. O biocontrole fúngico, feito por meio de bactérias seguras, tem ganhado cada vez mais espaço na agricultura. Bacillus spp. podem exercer atividade antifúngica através da produção de peptídeos, sideróforos e compostos orgânicos voláteis (COVs), entre outros metabólitos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o volatiloma de quatro cepas amazônicas de Bacillus velezensis e o efeito antifúngico dos seus COVs in vitro e in situ. A atividade antifúngica dos COVS foi avaliada por meio de ensaios in vitro (inibição do crescimento micelial e germinação de esporos) e in situ (em uvas). O volatiloma das 4 cepas foi analisado por microextração em fase sólida no modo headspace associada à cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massas do tipo quadrupolo (HS-SPME-GC/qMS) Os resultados demonstram que os COVs produzidos pelas cepas de B. velezensis P1, P7, P11 e P45 foram capazes de inibir o crescimento fúngico de Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Aspergillus. carbonarius, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus westerdijkiae, e Penicillium expansum entre 73 a 100%. A germinação de esporos foi inibida pelos COVs das 4 cepas em pelo menos 69%. A cepa P1 demonstrou ser a mais eficiente pois as taxas de inibição dos seus COVs in vitro foram superiores a 91%. Esta cepa, quando avaliada em uvas, foi capaz de inibir totalmente o desenvolvimento fúngico de 6 dos 7 fungos em estudo. A. flavus foi o único fungo capaz de crescer nas uvas expostas aos COVs da cepa P1, a qual apresentou uma eficiência de 50% na supressão do desenvolvimento deste fungo. Apesar do crescimento de A. flavus nas uvas, as rotas relacionadas à síntese aflatoxinas foram inibidas. Foram identificados 47 COVs no volatiloma das cepas de B. velezensis. A análise hierárquica de cluster (HCA) demonstrou que a cepa P1 apresenta perfil volátil mais distinto em comparação às demais. Conforme evidenciado pelo mapa de calor, a cepa P1 apresentou os maiores níveis de 3-hidroxi-3-metil-2-butanona, 2,3-butanediona (diacetyl), 3-octanona, 2-decanona, 2-hexadecanona, tetrametil-pyrazina, benzotiazol, α-farneseno, acetato de butila, 5-metil-2-heptanona, 2,3-dimetil-pyrazina, 3,5-dietil-2-metil-pyrazina e α-farnesol. Entretanto, nenhum COV foi individualmente correlacionado com a eficiência antifúngica das cepas de B. velezensis. Portanto, efeitos aditivos e/ou sinérgicos podem explicar a atividade antifúngica dos COVs. O uso das cepas de B. velezensis P1, P7, P11 e P45 em bioprodutos é promissora, devido à ação antifúngica dos COVs mesmo à distância, sem a necessidade do contato direto com patógenos e plantas.

Fungal contamination is a concern for the quality and productivity of grapes, as it leads to economic losses. In addition, some fungi are capable of producing toxic secondary metabolites, mycotoxins. The use of synthetic pesticides is widespread to combat fungi in viticulture, but they raise concerns due to the damage to the environment and health. In view of this, the search for new alternatives to reduce or replace pesticides is becoming increasingly important. Fungal biocontrol, carried out using safe bacteria, has been gaining more and more space in agriculture. Bacillus spp. can exert antifungal activity through the production of peptides, siderophores and volatile organic compounds (VOCs), among other metabolites. The objective of this study was to evaluate the volatilome of four Amazonian strains of Bacillus velezensis and the antifungal effect of their VOCs in vitro and in situ. The antifungal activity of VOCs was evaluated by in vitro (inhibition of mycelial growth and spore germination) and in situ (in grapes) assays. The volatility of the four strains was analyzed by headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography with quadrupole mass spectrometry (HS-SPME-GC/qMS). The results demonstrate that the VOCs produced by B. velezensis strains P1, P7, P11, and P45 were able to inhibit the fungal growth of Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Aspergillus carbonarius, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus westerdijkiae, and Penicillium expansum between 73 and 100%. Spore germination was inhibited by VOCs from the four strains by at least 69%. Strain P1 proved to be the most efficient, as the inhibition rates of its VOCs in vitro were higher than 91%. When evaluated on grapes, this strain was able to completely inhibit the fungal development of 6 of the 7 fungi under study. A. flavus was the only fungus capable of growing on grapes exposed to VOCs from strain P1, which showed a 50% efficiency in suppressing the development of this fungus. Despite the growth of A. flavus on grapes, the pathways related to aflatoxin synthesis were inhibited. A total of 47 VOCs were identified in the volatilome of B. velezensis strains. Hierarchical cluster analysis (HCA) demonstrated that strain P1 has a more distinct volatile profile compared to the others. As evidenced by the heat map, strain P1 presented the highest levels of 3-hydroxy-3-methyl-2-butanone, 2,3-butanedione (diacetyl), 3-octanone, 2-decanone, 2-hexadecanone, tetramethyl-pyrazine, benzothiazole, α-farnesene, butyl acetate, 5-methyl-2-heptanone, 2,3-dimethyl-pyrazine, 3,5-diethyl-2-methyl-pyrazine, and α-farnesol. However, no VOC was individually correlated with the antifungal efficiency of B. velezensis strains. Therefore, additive and/or synergistic effects may explain the antifungal activity of VOCs. The use of B. velezensis strains P1, P7, P11 and P45 in bioproducts is promising, due to the antifungal action of VOCs even at a distance, without the need for direct contact with pathogens and plants