Desenvolvimento e validação de técnicas moleculares de detecção de vírus, bactérias e fitoplasmas transmitidos por material propagativo de oliveira

Abstract

O cultivo da oliveira (Olea europaea L.), planta arbórea responsável pela produção de azeitonas e do azeite de oliva, vem crescendo no Rio Grande do Sul. Tendo em vista a ausência de técnicas moleculares validadas e de um programa de certificação, no Brasil, que garanta a qualidade fitossanitária do material propagado, neste trabalho foram desenvolvidos e validados protocolos de RT-PCR e PCR em tempo real para detecção dos principais patógenos da oliveira transmitidos através do material propagativo. Foram desenhados iniciadores e sondas TaqMan para a detecção dos vírus ArMV, CLRV, CMV, SLRSV e OLYaV, utilizando sequencias do GenBank e o programa Primer Express. Para as bactérias Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Pss) e Xylella fastidiosa subsp. pauca (Xfp), e para fitoplasmas, foram utilizados iniciadores e sondas TaqMan descritos na literatura. Estes marcadores e protocolos foram validados, avaliando os parâmetros de sensibilidade, especificidade, acurácia, ciclo de corte, limite de detecção (LD), repetitividade e reprodutibilidade segundo recomendações da “European and Mediterranean Plant Protection Organization” (EPPO). A determinação da prevalência dos patógenos foi realizada a partir da análise de plantas de um viveiro e plantio comerciais, nos cultivares Arbequina, Arbosana, Koroneiki, Picual, Frantoio e Coratina. Os resultados demonstraram, de modo geral, bom estado sanitário das plantas, com resultado negativo para todas as plantas frente a Xfp, Pss, ArMV, CMV, CLRV e SLRSV. A análise de fitoplasmas revelou a presença em 0,75% das amostras de viveiro, com resultados positivos em plantas dos cvs. Arbequina, Picual e Coratina. O vírus OLYaV, foi detectado em 100% das plantas da cv. Coratina, tanto no viveiro quanto no plantio comercial. Este é o primeiro relato da presença de vírus em plantas de oliveiras no Brasil. O desenvolvimento e validação de técnicas de detecção é uma importante ferramenta que permitirá a multiplicação de material vegetal livre dos principais patógenos do cultivo, além de fornecer subsídios para a implementação de um programa oficial de certificação de qualidade sanitária das mudas de oliveira.

The cultivation of the olive tree (Olea europaea L.), a tree plant responsible for the production of olives and olive oil, has been growing in Rio Grande do Sul. In view of the absence of validated molecular techniques and a certification program in Brazil, which guarantees the phytosanitary quality of the propagated material, in this work RT-PCR and PCR protocols were developed and validated in real time to detect the main pathogens of the olive tree transmitted through the propagating material. Primers and probes TaqMan were designed to detect ArMV, CLRV, CMV, SLRSV and OLYaV viruses, using GenBank sequences and using the Primer Express program. For bacteria Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Pss) and Xylella fastidiosa subsp. pauca (Xfp), and for phytoplasmas, primers and probes TaqMan described in the literature were used. These markers and protocols were validated, evaluating the parameters of sensitivity, specificity, accuracy, cutting cycle, detection limit (LD), repeatability and reproducibility according to recommendations of the “European and Mediterranean Plant Protection Organization” (EPPO). The determination of the prevalence of pathogens was carried out from the analysis of plants from a commercial nursery and planting, in the cultivars Arbequina, Arbosana, Koroneiki, Picual, Frantoio and Coratina. The results showed, in general, a good sanitary condition of the plants, with a negative result for all plants in relation to Xfp, Pss, ArMV, CMV, CLRV and SLRSV. Phytoplasma analysis revealed the presence in 0.75% of the nursery samples, with positive results in cvs plants. Arbequina, Picual and Coratina. The OLYaV virus was detected in 100% of cv. Coratina, both in the nursery and in commercial planting. This is the first report of the presence of viruses in olive plants in Brazil. The development and validation of detection techniques is an important tool that will allow the multiplication of plant material free of the main pathogens of cultivation, in addition to providing subsidies for the implementation of an official program for the certification of sanitary quality of olive seedlings.