Revisão da patologia molecular e estratégia para a investigação de pacientes com suspeita clínica de esclerose tuberosa e diagnóstico molecular convencional inconclusivo

Abstract

Tuberous Sclerosis (TE) is an autosomal dominant disease with diverse clinical manifestations affecting multiple tissues. Although the clinical diagnosis of these disorders can usually be made by the phenotype at birth or during early childhood, molecular diagnosis is important for genetic counseling. It is also particularly important in cases of atypical presentation, where clinical features are insufficient for diagnosis. More recently, with the advent of personalized medicine, molecular diagnosis may become even more important for defining candidates to receive such interventions. Molecular diagnosis is usually performed by next generation sequencing (NGS) and copy number variation (CNV) analysis, followed by classification of the variants detected using guidelines such as those of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) and/or Sherloc. These criteria categorize variants as: pathogenic, probably pathogenic, probably benign, benign and variants of uncertain significance (VUS). A proportion of patients with ET who undergo molecular diagnosis have no pathogenic variant identified. In about 8% of suspected or clinically diagnosed cases, VUS are identified, and in 10-40% of these patients there is no pathogenic variant identified using direct germline DNA analysis. On the other hand, several authors report that the frequency of variants affecting messenger RNA processing may be as high as 11-16%, but the frequency of such alterations in Brazilian patients remains unknown. For this reason, the present study aims to: Perform a detailed analysis of the variants identified in TSC1 and TSC2 in a public molecular database and establish a methodology to identify pathogenic variants causing alterations at the RNA level in patients with a clinical diagnosis of tuberous sclerosis and a negative or inconclusive molecular diagnosis result. The review showed that VUS are the most described variants in TSC1/2 in the ClinVar database, with little information about them. Many of these variants present conflicts in the interpretation of clinical significance, highlighting the importance of functional studies; however, few studies on this topic were identified in the literature (n=12). Most of these variants show similarity with benign variants. However, variants that show change in the reading array, swapped sense, and are in canonical regions of splicing have a potential for reclassification as pathogenic. The lack of information about them hinders the reclassification in ClinVar and has direct impact for genetic counseling of patients affected with such variants, reinforcing the need to submit as much information about variants detected in public databases as possible. With the data available in the ClinVar database, it was not possible to identify a hotspot of pathogenic variants in both genes. To analyze the role of VUS and identify possible intronic variants, four patients with clinically suspected tuberous sclerosis and with negative conventional genetic test for cDNA analysis were recruited. For this, primer blocks spanning the entire transcripts of the TSC1/2 genes were designed. PCR amplification reactions of all TSC1/2 primers were standardized, all PCR amplifications of the four patients with suspected TSC were performed, and to date, no processing alterations (assessed by amplicon size differences) have been identified. Establishing a screening protocol for variants that result in aberrant RNA processing is of significant clinical utility in the care of patients with suspected SCD and their families. Ultimately, our goal is to contribute to the implementation of this methodology as part of molecular diagnosis in negative/VUS cases. Finally, a better understanding of variants in TSC1/2 deposited in a public database, as well as standardization of a methodology to analyze role of VUS and/or identification of possible intronic variants in conventional genetic test negative cases may result in further understanding of the molecular pathogenesis of tuberous sclerosis and optimization of clinical management, in particular genetic counseling of patients with the disease.

A Esclerose Tuberosa (ET) é uma doença autossômica dominante com diversas manifestações clínicas afetando múltiplos tecidos. Embora o diagnóstico clínico desses distúrbios geralmente possa ser feito pelo fenótipo no nascimento ou durante o início da infância, o diagnóstico molecular é importante para aconselhamento genético. Também é particularmente importante nos casos de apresentação atípica, em que as características clínicas são insuficientes para o diagnóstico. Mais recentemente, com o advento da medicina personalizada, o diagnóstico molecular pode se tornar ainda mais importante para definir os candidatos a receberem tais intervenções. O diagnóstico molecular é geralmente realizado por sequenciamento de nova geração (do inglês next generation sequencing, NGS) e análise de variação do número de cópias (do inglês copy number variation, CNV), seguido da classificação das variantes detectadas usando diretrizes como as do American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) e/ou Sherloc. Esses critérios categorizam as variantes como: patogênicas, provavelmente patogênicas, provavelmente benignas, benignas e variantes de significado incerto (do inglês variant of uncertain significance, VUS). Uma proporção de pacientes com ET submetidos a diagnóstico molecular não tem variante patogênica identificada. Em cerca de 8% dos casos com suspeita ou diagnóstico clínico são identificadas VUS e em 10-40% destes pacientes não há variante patogênica identificada usando análise direta de DNA germinativo. Por outro lado, vários autores relatam que a frequência de variantes que afetam o processamento de RNA mensageiro pode chegar a 11- 16%, mas a frequência de tais alterações em pacientes brasileiros permanece desconhecida. Por esse motivo, o presente estudo tem como objetivo: Realizar uma análise detalhada das variantes identificadas em TSC1 e TSC2 constantes em uma base de dados moleculares pública e estabelecer uma metodologia para identificar variantes patogênicas causadoras de alteração ao nível do RNA em pacientes com diagnóstico clínico de esclerose tuberosa e resultado de diagnóstico molecular negativo ou inconclusivo. A revisão mostrou que as VUS são as variantes em TSC1/2 mais descritas no banco de dados ClinVar, com pouca informação sobre elas. Muitas dessas variantes apresentam conflitos na interpretação de significância clínica, ressaltando a importância de estudos funcionais; entretanto, foram identificados poucos estudos sobre essa temática na literatura (n=12). A maioria dessas variantes apresentam similaridade com variantes benignas. No entanto, variantes que apresentam mudança na matriz de leitura, sentido trocado e que estão em regiões canônicas de splicing tem um potencial de reclassificação como patogênicas. A falta de informação sobre elas dificulta a reclassificação no ClinVar e tem impacto direto para aconselhamento genético de pacientes acometidos com tais variantes, reforçando a necessidade de submeter o máximo de informações sobre variantes detectadas em banco de dados públicos. Com os dados disponíveis na base ClinVar, não foi possível identificar um hotspot de variantes patogênicas em ambos os genes. Para analisar o papel de VUS e identificar possíveis variantes intrônicas, foram recrutados quatro pacientes com suspeita clínica de esclerose tuberosa e com teste genético convencional negativo para análise de cDNA. Para isto, foram desenhados blocos de primers que abrangem a totalidade dos transcritos dos genes TSC1/2. Reações de amplificação por PCR de todos os primers TSC1/2 foram padronizados, todas as amplificações por PCR dos quatro pacientes com suspeita de TSC foram realizadas e, até o momento, nenhuma alteração de processamento (avaliada por diferenças de tamanho dos amplicons) foi identificada. O estabelecimento de um protocolo de triagem para variantes que resultam em processamento de RNA aberrante é de utilidade clínica significativa no cuidado de pacientes com suspeita de ET e seus familiares. Em última análise, nosso objetivo é contribuir para a implementação dessa metodologia como parte do diagnóstico molecular em casos negativos/VUS. Por fim, um melhor entendimento das variantes em TSC1/2 depositadas em um banco de dados público, assim como a padronização de uma metodologia para analisar papel de VUS e/ou identificação de possíveis variantes intrônicas em casos negativos de teste genético convencional podem resultar em maior compreensão da patogênese molecular da esclerose tuberosa e otimização do manejo clínico, em especial, aconselhamento genético de pacientes com a doença.