Associação entre variantes nos genes TNF, IL6 e IL1B e gravidade da Covid-19

Abstract

A Covid-19 (doença do coronavírus 2019), é uma doença infecciosa causada pelo Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 (SARS-CoV-2) é transmitida principalmente pelo contato direto do indivíduo infectado. Em março de 2020, a Organização Mundial da Saúde declarou a Covid-19 como uma pandemia. É observado um grande espectro das manifestações clínicas da doença, mas de forma geral a mediana de idade dos pacientes de Covid-19 internados é de 58 anos (IQR: 44-72), e os homens compõem a maior parcela de casos graves. As comorbidades mais comuns relatadas são doenças cardíacas, diabetes, hipertensão e obesidade. Os pacientes de Covid-19 podem ser classificados de acordo com a gravidade de seus sintomas, enquanto os sintomáticos leves apresentam sintomas gripais (tosse, falta de ar, febre e fadiga), alguns pacientes desenvolvem Covid-19 grave, e necessitam de internação em unidade de terapia intensiva (UTI) e ventilação mecânica. Foi observado que concentrações mais altas de interleucina (IL)-6, IL-1β e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α), se correlacionaram com a gravidade da doença. Vários estudos mostraram aumento de IL-6 em pacientes hospitalizados com Covid-19 e sua associação com gravidade e mortalidade. A IL-1β é um mediador essencial da resposta inflamatória e, assim como a IL-6, está envolvida em vários processos celulares durante a resposta imune, como proliferação, diferenciação e apoptose celular. Níveis elevados de IL- 1β no tecido pulmonar têm sido associados a desfechos graves de Covid-19, incluindo ventilação mecânica invasiva. Alguns estudos também relacionam o TNF- alfa como biomarcador de gravidade. Os níveis dessas citocinas são regulados por diferentes fatores, incluindo variantes genéticas, e é bem conhecido que variantes genéticas do hospedeiro desempenham um papel fundamental na suscetibilidade ou gravidade de diferentes infecções virais. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar variantes genéticas funcionais nos genes TNF (rs1799964, rs1800630, rs1799724, rs1800629 e rs361525), IL6 (rs2069832, rs2069840, rs2069845 e rs1800795), e IL1B (rs4848306, rs1143623, rs16944 e rs1143627), e correlacioná- las aos desfechos da Covid-19. Avaliamos uma amostra de 439 indivíduos com teste RT-PCR positivo para SARS-Cov-2, coletados de abril de 2020 a março de 2021, diagnosticando pelo Laboratório Central do Rio Grande do Sul (LACEN). Dados clínicos e demográficos da amostra foram obtidos a partir do registro do Sistema de Notificações de Síndromes Respiratórias Agudas Graves (SIVEP- GRIPE) e o DNA do hospedeiro foi extraído a partir de swabs nasofaríngeos coletados para diagnóstico. A extração do DNA ocorreu por uma metodologia de salting out desenvolvida in house e a genotipagem das variantes foi realizada por PCR em tempo real com ensaios TaqMan. As análises descritivas das características clínico-demográficas da amostra foram apresentadas como frequências absolutas e relativas, assim como medianas e intervalos interquartil. As comparações entre as frequências alélicas e genotípicas para pacientes hospitalizados e não hospitalizados foi realizada através do teste de qui-quadrado e a avaliação do risco do alelo ou genótipo nos desfechos foi analisada por regressão de Poisson com variâncias robustas. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. O número total de pacientes analisados foi de 439 indivíduos, sendo que 217 (49,4%) foram hospitalizados e o número de indivíduos que não necessitam de internação foi de 210 (47,8%). Os homens representaram 56,6% dos pacientes com necessidade de internação, e a mediana de idade geral da amostra foi de 53 anos (IQR 36,0- 69,0). Em relação aos sintomas da Covid-19, febre, e tosse foram registradas com maior frequência entre todos os pacientes. Fadiga, dificuldade para respirar e saturação de oxigênio <95% foram relatadas com maior frequência entre os indivíduos que necessitaram de internação, enquanto dor de garganta e perda de paladar e olfato foram estatisticamente associadas ao grupo de indivíduos que não necessitou de internação. As comorbidades mais prevalentes foram cardiopatias (81,1%, p < 0,001) e diabetes (81,1%, p < 0,001), ambas mais frequentes em pacientes hospitalizados. As frequências alélicas e genotípicas não diferiram entre hospitalizados e não hospitalizados para as variantes de IL6 e IL1B. Para o gene TNF, as variantes -1031T>C (rs1799964), -863C>A (rs1800630), -857C>T (rs1799724) mostraram-se estatisticamente diferentes entre hospitalizados e não hospitalizados. Embora nenhuma variante de IL1B tenha se mostrado estatisticamente diferente entre os grupos, um modelo de regressão de Poisson foi analisado considerando a variante -511 de IL1B (rs16944) que apresentou uma diferença genotípica entre grupos com um valor de p=0,15. Neste modelo, o genótipo AG de IL1B -511 (rs16944) foi associado a um caráter protetor em relação a desfechos mais graves da Covid-19 (RR 0.75, 95% CI 0.62-0.91, p < 0.001). A variante -1031T>C (rs1799964) foi a única que permaneceu estatisticamente significativa no modelo multivariado de regressão de Poisson. O genótipo CT apresentou um caráter protetor para a gravidade da Covid-19 (RR 0,74, IC 95% 0,61-0,91, p < 0,001). Embora não tenhamos encontrado outros estudos avaliando o impacto especificamente dessas variantes na Covid-19, podemos levantar a hipótese de que a presença de ambos os alelos desses genes no genótipo heterozigoto poderia ser benéfica devido ao equilíbrio na expressão de citocinas, já que ambas as variantes são funcionais e impactam a expressão dos genes. Este é o primeiro estudo a encontrar associações entre variantes de IL1B e TNF relacionadas ao desfecho da Covid-19 na população brasileira. As análises e resultados obtidos nesse estudo podem contribuir para a compreensão da variabilidade imunogenética do hospedeiro humano e os diferentes desfechos da Covid-19.

Covid-19 (coronavirus disease 2019) is an infectious disease caused by the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is transmitted especially through direct contact with the infected individual. In March 2020, World Health Organization declared Covid-19 as a pandemic. A great spectrum of the disease's clinical manifestations is observed, although, in general, the median age of the patients hospitalized due to Covid-19 is 58 years (IQR: 44-72), and men represent the majority of severe cases. The most common comorbidities are cardiac diseases, diabetes, and obesity. Patients with Covid-19 can be classified according to the symptoms’ severity; mild patients present flu-like symptoms (cough, shortness of breath, fever, and fatigue), whilst some patients develop severe Covid-19, needing to be hospitalized in Intensive Care Units (ICU) and mechanical ventilation. It was observed that increased levels of interleukin (IL)-6, IL-1β, and Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) are correlated with the severity of the disease. Several studies have demonstrated an increase in IL-6 levels in patients hospitalized with Covid-19 and its association with severity and mortality. IL-1β is an essential mediator of the inflammatory response and, like IL-6, it is involved in several cellular processes during the immune response, including proliferation, differentiation, and apoptosis. Elevated levels of IL-1β in the lung tissue have been associated with severe outcomes of Covid-19, including invasive mechanical ventilation. Some studies have also associated TNF-alpha as a severity biomarker. Different factors regulate the levels of these cytokines, including genetic variants, being also established the host’s genetic variants have a central role in the susceptibility and severity of different viral infections. Hence, this study aimed to evaluate functional genetic variants in TNF (rs1799964, rs1800630, rs1799724, rs1800629 and rs361525), IL6 (rs2069832, rs2069840, rs2069845 and rs1800795), and IL1B (rs4848306, rs1143623, rs16944 and rs1143627) genes and correlate them to the Covid-19 outcomes. We evaluated a sample of 439 individuals with positive RT-PCR tests for SARS-Cov-2 infection, collected between April 2020 and March 2021, being diagnosed in the Laboratório Central do Rio Grande do Sul (LACEN-RS). The sample’s clinical and demographic data were obtained through the notification system named Sistema de Notificações de Síndromes Respiratórias Graves (SIVEP-GRIPE); the host’s DNA was extracted through nasopharyngeal swabs collected for diagnostic purposes. DNA extraction was conducted using a salting- out methodology developed in house and variants genotyping was performed by real-time PCR using TaqMan assays. Descriptive analysis of the sample’s clinical and demographic characteristics was presented as absolute and relative frequencies, including medians and interquartile intervals. Comparisons between allelic and genotypic frequencies of the hospitalized and non-hospitalized patients were performed through the Chi-Square test and risk allele or genotype evaluation regarding the outcome was analyzed through Poisson regression with robust variances. The study was approved by the Ethics Committee in Research of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. The total sample size analyzed was 439 individuals, 217 (49.4%) were hospitalized, and 210 (47.8%) did not need hospitalization. Men represented 56.6% of the patients that needed hospitalization, and the median age of the whole sample was 53 years (IQR 36.0-69.0). Regarding Covid-19 symptoms, fever and cough were registered more frequently in all the patients. Fatigue, dyspnea, and oxygen saturation < 95% were reported more frequently in the hospitalized group; sore throat, taste, and smell loss were statistically associated with the group that was not hospitalized. The most prevalent comorbidities were cardiac diseases (81.1%, p < 0.001) and diabetes (81.1%, p < 0.001), both more frequent in hospitalized patients. The allelic and genotypic frequencies were similar between hospitalized and non-hospitalized groups for the IL6 and IL1B gene variants. For the TNF gene variants, -1031T>C (rs1799964), - 863C>A (rs1800630), and -857C>T (rs1799724), allelic and genotypic frequencies were different between the groups analyzed. Although statistical differences were not encountered for IL1B variants, a Poisson regression model was performed comprising the -511 variant of IL1B (rs16944), which presented a genotypic difference between groups, with a P-Value = 0,15. In this model, the genotype AG of IL1B -511 (rs16944) was associated with a protective character, when compared to the severe outcomes of Covid-19 (RR 0.75, 95% CI 0.62-0.91, p < 0.001). Variant -1031T>C (rs1799964) of TNF was the only statistically significant one considering the multivariate Poisson regression model. Genotype CT presented a protective character regarding Covid-19 severity (RR 0,74, IC 95% 0,61-0,91, p < 0,001). Although we have not encountered other studies evaluating specifically the impact of these variants in Covid-19, we can hypothesize the presence of both these genes’ alleles (heterozygous genotype) might benefit the patient because of the balance in the cytokine’s expression, since both variants are functional and impact the genes expression. This is the first study to encounter associations between the IL1B and TNF variants regarding Covid-19 outcomes in the Brazilian population. The analyses and results here obtained might contribute to the understanding of the host’s immunogenetics variability and the different outcomes of Covid-19.