Análise do gene 5-HTT e investigação da possibilidade de interação com o gene DRD4 na etiologia do Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade

Abstract

O Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH), com prevalência estimada em 5,29%, é um dos transtornos psiquiátricos mais comuns da infância e da adolescência e caracteriza-se clinicamente por um quadro persistente de desatenção e/ou hiperatividade/impulsividade mais severo do que o esperado para indivíduos com nível comparável de desenvolvimento. O TDAH é um fenótipo bastante complexo e de herança multifatorial, porém com alta herdabilidade (~76%), fato que impulsiona a busca por genes de susceptibilidade. Estudos de associação, apoiados em hipóteses biológicas a priori, vêm focando especialmente em genes do sistema dopaminérgico. Dentre esses, o gene do receptor D4 de dopamina (DRD4) é objeto de intensa investigação, sendo sugerido como um locus de suscetibilidade ao TDAH. Embora existam resultados conflitantes, o alelo de 7 repetições gerado por um VNTR de 48pb localizado no exon 3 parece ser o principal alelo de risco. Evidências neurobiológicas também sugerem o envolvimento do sistema serotoninérgico. O principal locus investigado é o gene do transportador de serotonina (5-HTT), através do marcador 5-HTTLPR, um indel de 44pb na região promotora que possui efeito funcional. Tanto resultados positivos quanto negativos já foram verificados em estudos de associação com o TDAH, tendo sido sugerido o alelo longo (L) como de risco. Entretanto, estes estudos não têm explorado um SNP presente na inserção de 44pb (A>G, rs25531), descrito mais recentemente e que influencia fortemente a eficácia transcricional do gene, sendo sugerida a sua inclusão em estudos futuros e para corroborar achados prévios. A natureza complexa do fenótipo TDAH impõe ainda a necessidade do emprego de análises que contemplem modelos etiológicos mais elaborados e adequados para a busca por genes de susceptibilidade, tais como as análises de interação gene-gene. O presente trabalho objetivou, então, testar duas hipóteses: 1) a participação do gene 5-HTT na etiologia do TDAH, por meio da análise do sistema trialélico (5-HTTLPR/ rs25531) e 2) a possibilidade de interação entre os genes 5- HTT (5-HTTLPR/ rs25531) e DRD4 (VNTR de 48pb) na expressão desse fenótipo. A amostra utilizada foi obtida junto ao Programa do Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (ProDAH/HCPA) e em escolas públicas de Porto Alegre, consistindo de 478 crianças e/ou adolescentes com TDAH, diagnosticados de acordo com os critérios do DSM-IV, seus pais biológicos e 100 indivíduos controles. Os polimorfismos do gene 5-HTT foram genotipados por PCR convencional e detecção em gel, sendo necessária também incubação com a endonuclease MspI para a discriminação do rs25531. O polimorfismo do gene DRD4 foi genotipado em estudos prévios realizados pelo nosso grupo. A hipótese de associação com o 5-HTT foi testada por um método baseado em famílias (FBAT) e a hipótese de interação entre os loci foi testada através de: 1) teste qui- quadrado de Pearson; 2) regressão logística binária e 3) ANOVA de uma via. Para as análises de interação, os pacientes foram agrupados como portadores e não portadores do alelo 7R para o gene DRD4 e de acordo com a suposta eficácia dos alelos para o 5-HTT (baixa = SS, SLG e LGLG; média = SLA e LALG; alta = LALA). O estudo de associação não mostrou nenhum resultado positivo, tanto para a amostra total do ProDAH quanto em subgrupos de pacientes definidos por critérios clínicos (0,152≤P≤0,902). Similarmente, nenhuma das abordagens que testaram interação gene-gene teve resultados com significância estatística (0,073≤P≤0,852). Em relação ao 5-HTT, ao replicarmos na forma trialélica um resultado prévio obtido em nossa amostra com a forma bialélica, acreditamos que não tenha efeito em nossa população, embora heterogeneidade genética/alélica pode explicar a divergência em comparação à literatura. Uma caracterização ―população-específica‖ do locus 5-HTT, aliada a estudos de funcionalidade com diferentes polimorfismos, parece ser fundamental para apontar a real significância do sistema 5-HTTLPR/rs25531 na função deste gene, e, consequentemente, no TDAH, nas diferentes amostras estudadas. Em relação às abordagens de interação gene-gene, os resultados negativos não devem ser encarados como definitivos, uma vez que há ainda muitas limitações e divergências nas metodologias utilizadas atualmente. Diferentes modelos de interação, juntamente com a investigação de clusters gênicos, podem ajudar a compreender de forma mais exata a participação de diferentes genes na etiologia do TDAH, incluindo os genes 5-HTT e DRD4. Acreditamos ainda que a natureza pioneira do presente estudo possa estimular investigações futuras sobre os aspectos aqui discutidos.

Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is one of the most common psychiatric disorders of childhood and adolescence, with an estimated prevalence of 5.29%. It is a complex phenotype and, clinically, is characterized by a persistent pattern of inattention and/or hyperactivity-impulsivity that is more severe than usually expected in individuals at a comparable developmental level. Although of multifactorial inheritance, the high heritability (~76%) of ADHD has been driven the search for susceptibility genes. Association studies, supported by a priori biological hypotheses have focused on dopaminergic genes. Among these, the most studied has been the dopamine D4 receptor gene (DRD4), suggested as a susceptibility locus in ADHD. Even with conflicting results, the 7 repeat allele created by a 48bp VNTR located at exon 3 seems to be the risk allele. Neurobiological evidences also indicate the involvement of serotonergic system. The serotonin transporter gene (5-HTT) has been the most investigated locus, through the 5-HTTLPR polymorphism, a 44bp indel at promoter region that shows functional effects. Both positive and negative results were verified in association studies, being the long (L) allele the putative risk one. However, these studies do not usually explore a SNP located into the 44bp insertion (A>G, rs25531), recently described and which strongly influences the gene’s transcriptional efficacy; its inclusion in future studies and for corroborating previous findings has been suggested. The complex nature of ADHD phenotype still requires the use of analyses considering more elaborated causal models, fitted to the search of susceptibility genes; in this regard, gene-gene interaction analyses would be a valid strategy. The aim of this study was therefore to test two hypotheses: 1) the involvement of 5-HTT gene in ADHD etiology, through the analysis of triallelic system (5-HTTLPR/ rs25531) and 2) the possibility of gene-gene interaction between 5-HTT and DRD4 (48bp VNTR) in the manifestation of this phenotype. The sample analyzed was obtained from Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder Outpatient Program hosted in Hospital de Clínicas de Porto Alegre (ProDAH/HCPA) and from public schools from Porto Alegre, consisting of 478 children and/or adolescents with ADHD diagnosed according DSM- IV criteria, their biological parents and 100 control individuals. 5-HTT polymorphisms were genotyped by conventional PCR and gel electrophoresis, being the incubation with the endonuclease MspI needed to discriminate rs25531 alleles. DRD4 polymorphism has already been genotyped in previous studies from our group. The association hypothesis with 5-HTT was tested by a family-based method (FBAT), while the interaction hypothesis was tested by: 1) Pearson’s chi-square test 2) binary logistic regression and 3) One-Way ANOVA. For this last purpose, patients were grouped according to the presence of 7R allele at DRD4 (7R- carriers vs. 7R-noncarriers) and according to putative transcriptional efficiency of different alleles at 5-HTT (low = SS, SLG e LGLG; mid = SLA and LALG; high = LALA). The association study did not show any positive result, either considering total ProDAH sample or considering subgroups of patients defined by clinical criteria (0.152≤P≤0.902). None of gene-gene interaction tests used was able to detect any result with statistical significance likewise (0.073≤P≤0.852). Regarding 5-HTT locus, the replication of previous biallelic results in our sample even using the triallelic system indicates that this gene does not influence ADHD in our population, although some genetic/allelic heterogeneity might explain the discordance with the literature. A population-based characterization of 5-HTT locus, along with functional studies of different polymorphisms seems to be crucial to reveal the real impact of 5- HTTLPR/rs25531 variants on gene’s function, and thus on ADHD, in the several investigated samples. Regarding gene-gene interaction tests, the negative results should not be understood as a definitive statement, since there are a lot of limitations and divergences in methods currently used in these analyses. Different interaction models and the analyses of gene clusters may help to elucidate the exact contribution of each gene in ADHD etiology, including 5-HTT e DRD4 locus. We also believe the pioneering nature of this study may work as a stimulus for further investigations on the issues presented herein.