Identificação de novos biomarcadores e potenciais alvos terapêuticos para a Doença de Gaucher: um estudo com ênfase na β2-microglobulina, ferritina e hepcidina

Abstract

INTRODUÇÃO: A Doença de Gaucher (DG) é uma esfingolipidose causada pela deficiência de β- glicosidase. Ela apresenta alterações multissistêmicas, que não são completamente tratadas com as modalidades atuais de tratamento. Mediadores humorais alterados, nesse sentido, têm contribuído tanto para o avanço da elucidação fisiopatológica e proposição de novos alvos terapêuticos quanto para a descoberta de novos biomarcadores. Entre tais, há sugestões na literatura de prejuízo à homeostase do ferro, fato relevante devido ao seu potencial de gerar estresse oxidativo e poder atuar como fator modificador da doença. OBJETIVOS: 1) propor, para a DG, hepcidina e β2-microglobulina como novos biomarcadores e avaliar a utilidade da ferritina (total e glicosilada) em pacientes brasileiros; 2) sugerir tanto o ferro como fator modificador quanto o mecanismo etiológico da anemia na DG e 3) identificar novos fármacos moduladores de hepcidina in vitro e in vivo. METODOLOGIA: Para os objetivos 1) e 2), a amostra foi proveniente do Centro de Referência para Doença de Gaucher do Rio Grande do Sul, os dados clínicos obtidos por meio de revisão dos prontuários e a quantificação de hepcidina, ferritina glicosilada e IL-6 realizadas por técnica de ELISA. Em relação ao objetivo 3), hepatócitos humanos com sistema reporter para hepcidina foram tratados com fármacos específicos e tiveram os efeitos in vitro aferidos espectrofotometricamente e com Real-Time PCR e Western Blot para genes e proteínas de interesse. Os efeitos in vivo foram testados em camundongos wild type ou HbbTh3+/− . RESULTADOS: Objetivo 1): avaliou-se β2-microglobulina em 31 pacientes com mediana de 2180 [1880-2919] ng/mL e correlação com quitotriosidase (ρ=0,65; p<0,01) e plaquetas (ρ=−0,42; p=0,02). Ainda, os escores de gravidade foram mais elevados em pacientes com elevação de β2- microglobulina do que nos sem elevação (4 [3–6,5] vs. 2,5 [1–4,2]; p=0,04). Comparações pré- e pós-tratamento revelaram redução da β2-microglobulina (2931 vs. 1970 ng/mL; p<0,01; n=8). Avaliou-se a hepcidina em 34 pacientes, nos quais a mediana foi 106,3 [72,1-194] ng/mL (referência 65,8 ng/mL) e correlacionada, em modelo de regressão múltipla, com quitotriosidase e ALT. Comparações pré- e pós-tratamento mostraram redução da hepcidina 101,2 [67,2-225] vs 57,3 [24,5-113,5] ng/mL (p=0,026; n=19). Não houve correlação com a forma glicosilada de ferritina, bem como não houve diferença dela com sua forma total. Ainda, avaliamos em 18 pacientes virgens de tratamento o efeito da terapia-padrão sobre a concentração sérica de ferritina total. Nesses, inicialmente havia hiperferritinemia, revertida após o tratamento (756 [318-1441] vs. 521 [227-626] ng/mL; p=0.025) e acompanhado de melhora clínica global. Não houve correlação com gravidade. Objetivo 2) a hepcidina se correlacionou com IL-6 ("=0,36; p=0,038; n=34) e VCM ("=-0,37; p=0,035; n=33). Após um período de observação, juntamente com a redução dos níveis de hepcidina, houve incremento na saturação de transferrina (24 [17,6-27,6] vs. 31,6 [24,3-35,9]%; p=0,023; n=23), no ferro sérico (78 [57-90] vs. 86 [76,5-102] μg/mL; p=0,037; n=25) e VCM (84,6 [79,7-90,3] vs. 87,7 [82,3-93,1] fL; p<0,001; n=33). Objetivo 3) identificamos 13 fármacos com efeito na expressão hepcidina. Mostramos também que a ipriflavona reduz o ferro hepático e a expressão intestinal de ferroportina, bem como aumenta os transcritos e a concentração sérica de hepcidina em camundongos wild type. CONCLUSÃO: Propomos a hepcidina e a β2-microglobulina como novos biomarcadores e comprovamos a utilidade da ferritina total como biomarcador de resposta ao tratamento em pacientes brasileiros com DG. Hepcidina e IL-6 elevados e hipoferremia com microcitose, revertidos após um período sob tratamento, sugerem a anemia inflamatória como a etiologia na DG e sugerem que pode haver sobrecarga tecidual de ferro paradoxal. Por fim, os fármacos identificados, além de representarem potenciais medicamentos moduladores do metabolismo do ferro, forneceram as bases para que estratégias similares sejam testadas em modelos de DG, resultando em novas terapias para a DG.

INTRODUCTION: Gaucher disease (GD) is a sphingolipidosis caused by β-glucosidase deficiency. It presents multisystemic changes, which are not completely treated with current treatment modalities. In this sense, altered humoral mediators have contributed both to the advancement of pathophysiological comprehension and the proposition of new therapeutic targets and discovery of new biomarkers. Accordingly, there are suggestions in the literature of iron dishomeostasis, fact due that is relevant because of its potential to generate oxidative stress and to potentially act as a disease modifying factor. OBJECTIVES: 1) to propose, for GD, hepcidin and β2-microglobulin as new biomarkers and to evaluate the utility of ferritin (total and glycosylated) in Brazilian patients; 2) suggest both iron as modifying factor and the etiological mechanism of anemia in GD and 3) identify new synthetic hepcidin modulators in vitro and in vivo. METHODOLOGY: For the purposes 1) and 2), the sample was obtained from the Reference Center for Gaucher Disease of Rio Grande do Sul, the clinical data obtained through chart review and quantification of hepcidin, glycosylated ferritin and IL- 6 were performed by ELISA approaches. In relation to objective 3), human hepatocytes with reporter system for hepcidin were treated with specific drugs and had their in vitro effects measured spectrophotometrically and subsequentially confirmed with Real-Time PCR and Western Blot for genes and proteins of interest. In vivo effects were tested on wild type or HbbTh3 +/- mice. RESULTS: Objective 1): β2-microglobulin was evaluated in 31 patients with a median of 2180 [1880-2919] ng/mL. Correlation was observed with chitotriosidase (ρ=0.65, p<0.01) and platelets (ρ=0.42, p=0.02). Furthermore, severity scores were higher in patients with β2-microglobulin elevation than in patients without elevation (4 [3-6.5] vs. 2.5 [1-4,2], p=0.04). Pre- and post-treatment comparisons revealed a reduction of β2-microglobulin (2931 vs. 1970 ng/mL, p<0.01, n=8). Hepcidin was evaluated in 34 patients, in which the median was 106.3 [72.1- 194] ng/mL (reference 65.8 ng/mL) and correlated in a multiple regression model with chitotriosidase and ALT. Pre- and post-treatment comparisons showed reduction of hepcidin levels 101.2 [67.2-225] vs 57.3 [24.5-113.5] ng/mL (p=0.026; n=19). There was no correlation with the glycosylated form of ferritin, nor was there any difference with its total form. Furthermore, we evaluated the effect of standard therapy on total ferritin serum concentration in 18 treatment-naive patients. In these patients, hyperferritinemia was reversed after treatment (756 [318-1441] vs. 521 [227-626] ng/mL, p=0.025) and accompanied by overall clinical improvement. There was no correlation with severity. Objective 2), hepcidin correlated with IL-6 (ρ=0.36, p=0.038, n=34) and MCV (ρ=-0.37, p=0.035, n=33). After the interval of the study, together with the reduction of hepcidin levels, there was an increase in transferrin saturation (24 [17.6-27.6] vs. 31.6 [24.3-35.9] %, p=(n=23), serum iron (78 [57-90] vs. 86 [76.5-102] μg/mL, p=0.037, n=25) and VCM (84.6 [79.7- 90.3] vs. 87.7 [82.3-93.1] fL; p<0.001; n=33). Objective 3) we identified 13 drugs showing effect on hepcidin expression. We have also shown that ipriflavone reduces hepatic iron and the intestinal expression of ferroportin, as well as increases the hepatic transcripts and the serum concentration of hepcidin in wild type mice. CONCLUSION: We propose hepcidin and β2- microglobulin as new biomarkers and we prove the usefulness of total ferritin as a biomarker of response to treatment in Brazilian patients with GD. Hepcidin and elevated IL-6 and hypoferremia with microcytosis, reversed after a period under treatment, suggest inflammatory anemia as the etiology in GD and suggest that paradoxical iron overload can occur in certain tissues contributing to the pathophysiology. Finally, the drugs identified, besides representing potential drugs modulating iron metabolism, provided the basis for similar strategies to be tested in GD models, resulting in new therapies for the disease.