Caracterização molecular de mutações em pacientes com doença de von Willebrand tipo 3

Abstract

O Fator von Willebrand (FvW) humano é uma glicoproteína plasmática, sintetizada nos megacariócitos e células endoteliais, que circula no plasma sob a forma de multímeros. O gene codificante do FvW está localizado no braço curto do cromossomo 12 e contém 178 kb distribuídos em 52 éxons. O FvW participa tanto da hemostasia primária, ligando-se ao tecido lesionado e recrutando plaquetas, quanto na hemostasia secundária estabilizando a molécula de FVIII, impedindo que esta seja degradada. O gene do VWF é transcrito em um mRNA de 9kb e é traduzido em um pré-pro-polipeptídeo contendo 2813 aminoácidos, sendo composto por uma pré-sequência, um pro-peptídeo e um monômero. Os processos pós traducionais do FvW incluem dimerização, glicosilação, sulfatação, clivagem do pró- peptídeo e multimerização; seguido de estocagem ou secreção. Os níveis plasmáticos normais de FvW, na população em geral, variam de 35 a 200 UI/dL. A doença de von Willebrand (DvW) é causada por anormalidades quantitativas ou qualitativas no FvW. Defeitos quantitativos causam a DvW tipo 1 e tipo 3. Por outro lado, anormalidades qualitativas causam a DvW tipo 2, que pode ser subdividida em tipos 2A, 2B, 2M e 2N. A DvW tipo 3 é uma deficiência quantitativa grave do FvW e é herdada de maneira autossômica recessiva. Os indivíduos com DvW tipo 3, apresentam níveis indetectáveis de FvW:Ag e também níveis muito baixos de FVIII. Pessoas com DvW tipo 3 podem apresentar sintomas clínicos como sangramentos mucocutâneos graves ou moderados, hematomas musculares e hemartroses. O grande tamanho, a sequência altamente polimórfica e a presença de um pseudogene complicam o rastreamento de variantes patogênicas no VWF. O presente estudo visa a caracterização molecular de mutações em pacientes com DvW3 no Rio Grande do Sul. O gene VWF foi sequenciado em 26 casos diagnosticados com DvW3 por sequenciamento de nova geração usando IonTorrent. O impacto das mutações de sentido trocado encontradas foi analisado utilizando 5 algoritmos: Mutationtaster, PROVEAN, SIFT, Polyphen-2 e HOPE. O sequenciamento por Sanger foi realizado para confirmar algumas mutações encontradas pelo método de NGS. O gene do VWF foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando 52 pares de primers. As sequências foram alinhadas com a sua referência (NM_000552.4) usando o software CodonCodeAligner implementado no MEGA 5.04. Foram identificadas 72 variantes diferentes: 31 intrônicas, 17 sinônimas, 16 sentido trocado, 6 deleção-inserção, 2 sem sentido. As mutações foram distribuídas em todo o gene, tendo maior prevalência no exon 28 (11%). Cinco novas mutações foram encontradas: c.6976 + 5G> T; c.6885_6886insC; c.3378C> T; c.3346_3347insCCA; c.2503G> T. Vinte e quatro pacientes tiveram mais de uma mutação patogênica que poderia explicar o fenótipo da doença. Dentre elas, 17 pacientes apresentaram as variantes (p.Pro2063Ser e p.Arg324*), a p.Pro2063Ser possui divergências entre ser uma mutação patogênica ou um polimorfismo neutro, então provavelmente a causa da doença nesses pacientes seja a p.Arg324*, que gera um stop códon prematuro. Como 60% dos pacientes apresentaram essa mutação e eles se localizam em regiões próximas do estado do Rio Grande do Sul, podemos sugerir que possa ter havido um efeito fundador, e um haplótipo com outras 13 variantes comuns pra esses 17 pacientes reforça essa hipótese. Usando um painel de sequenciamento de nova geração para o VWF, dentre os 26 pacientes, conseguimos detectar 50 dos 52 alelos em um grupo de pacientes brasileiros com diagnóstico clínico de DvW3. Apesar de todos os pacientes apresentarem sangramento grave, a variação na intensidade do sangramento, tipos de sangramento e necessidade de tratamento não puderam ser correlacionados com os tipos ou posição de suas mutações. No entanto, a análise molecular do VWF pode ser útil para fins de diagnóstico e aconselhamento.

Von Willebrand Factor (VWF) is a plasma glycoprotein, synthesized in megakaryocytes and endothelial cells, and circulates in plasma as multimers. The VWF coding gene is located on the short arm of chromosome 12 and contains 178 kb distributed in 52 exons. VWF participates in both primary hemostasis, binding to injured tissue and recruiting platelets, and secondary hemostasis by stabilizing the FVIII molecule, preventing it from being degraded. The VWF gene is transcribed into a 9kb mRNA and is translated into a pre-pro-polypeptide containing 2813 amino acids, consisting of a pre-sequence, a propeptide and a monomer. Post-translational processes of VWF include dimerization, glycosylation, sulfation, cleavage of the propeptide and multimerization; followed by storage or secretion. Normal VWF levels in the general population range from 35 to 200 IU/dL. Von Willebrand Disease (VWD) is caused by quantitative or qualitative abnormalities in VWF. Quantitative defects cause VWD type 1 and type 3. On the other hand, qualitative abnormalities cause VWD type 2, which can be subdivided into types 2A, 2B, 2M and 2N. VWD type 3 (VWD3) is a serious quantitative deficiency of VWF and is inherited in an autosomal recessive manner. Individuals with VWD3 have undetectable levels of VWF:Ag and also very low levels of FVIII. People with VWD3 may exhibit clinical symptoms such as severe or moderate mucocutaneous bleeding, muscle hematomas, and hemarthroses. Large size, highly polymorphic sequence and presence of a pseudogene complicate the screening of pathogenic variants in VWF. The present study aims at the molecular characterization of mutations in patients with VWD3 in Rio Grande do Sul. The VWF gene was sequenced in 26 cases diagnosed with VWD3 by new generation sequencing using Ion Torrent. The impact of the exchanged sense mutations was analyzed using 5 algorithms: Mutation taster, PROVEAN, S Mutation taster, PROVEAN, SIFT, Polyphen-2 and HOPE. Sanger sequencing was used to confirm a number ofmutations found in the NGS method. The VWF gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using 52 primer pairs. The strings were aligned with their reference (NM_000552.4) using the CodonCodeAligner software implemented in MEGA 5.04. We identified 72 different variants: 31 intronic, 17 synonymous, 16 missense, 6 deletion/insertion, and 2 nonsense. The mutations were distributed along the whole gene, having a higher prevalence in exon 28 (11%). Five novel mutations were found: c.6976+5G>T, c.6885_6886insC, c.3378C>T, c.3346_3347insCCA, and c.2503G> T. Twenty-four patients had more than one pathogenic mutation that could explain the disease phenotype. Among them, 17 patients presented the variants p.Pro2063Ser and p.Arg324*. The p.Pro2063Ser has controversies regarding the functional status of the variation. Both pathogenic and neutral results were found by the predictors, so probably the cause of the disease in these patients is p.Arg324* which generates a premature stop codon. As 60% of the patients presented this mutation and they live in neighboring regions in the state of Rio Grande do Sul, we can suggest that there may have been a founding effect. A haplotype with 13 other common variants found in these 17 patients reinforces this hypothesis. Using a next generation sequencing panel for VWF we were able to detect 50 out of 52 alleles in a set of 26 Brazilian patients clinically diagnosed withVWD3. However, despite all patients presented severe bleeding, the variation in their bleeding intensity, bleeding types and need of treatment could not be correlated with the types or position of their mutations. Nevertheless, the molecular analysis of VWF can be useful for both diagnostic and counselling purposes.