Validação de um método para a determinação de micotoxinas em cevada maltada e cerveja usando QuEChERS-LC-QToF-MS e calibração por superposição de matriz

Abstract

Micotoxinas são compostos tóxicos produzidos por fungos filamentosos. Os cereais são as culturas mais sensíveis à contaminação fúngica e, consequentemente, à presença de micotoxinas. As micotoxinas podem ser transferidas da cevada maltada contaminada para a cerveja. Na literatura, métodos para a análise de malte ou cerveja têm sido otimizados apenas para grupos de micotoxinas estruturalmente relacionadas, como tricotecenos (desoxinivalenol, toxinas T-2 e HT-2) e aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), ou apenas para toxinas de Fusarium. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um método para a quantificação simultânea de dezessete micotoxinas legisladas [aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), ocratoxina A (OTA), desoxinivalenol (DON), toxina T-2, toxina HT-2, fumonisina B1 (FB1) e zearalenona (ZEA)] e emergentes [beauvericina (BEA), eniatinas (A, A1, B e B1), moniliformina (MON) e esterigmatocistina (STG)] em cevada maltada e cerveja. A abordagem QuEChERS (acrônimo derivado do inglês: Quick (rápido), Easy (fácil), Cheap (barato), Effective (efetivo), Rugged (robusto) e Safe (seguro)) foi usada na etapa de preparação das amostras, seguida pela cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massas com analisador quadrupolo-tempo de voo (LC-QToF-MS). A calibração por superposição de matriz (MMC) foi empregada para superar o efeito de matriz. O desempenho geral do método foi satisfatório para quantificar todos os compostos em ambas as matrizes. O uso de curvas MMC foi crucial para evitar a quantificação incorreta dos analitos que mostraram um forte efeito de matriz: BEA (SSE: 105% para malte e cerveja) e ZEA (SSE: 165% e 120% para malte e cerveja, respectivamente) exibiram intensificação do sinal e DON (SSE de 32% e 15% para malte e cerveja, respectivamente) e MON (SSE de 29% e 15% para malte e cerveja, respectivamente) exibiram supressão do sinal. As curvas analíticas obtidas com MMC apresentaram linearidade e precisão aceitáveis, com coeficientes de determinação (R2 ) superiores a 0,99 para malte e cerveja e recuperações variando de 72 a 102% para malte e de 73 a 100% para cerveja. Os valores de limite de detecção (LOD) (0,01-15 μg kg-1 para malte e cerveja) e limite de quantificação (LOQ) (0,05-50 μg kg-1 para malte e cerveja) mostraram que o método é suficientemente sensível para determinar as 17 micotoxinas. Além disso, a precisão e a sensibilidade estavam de acordo com as diferentes diretrizes de validação de método. Outra vantagem foi o rendimento aprimorado, exigindo 1,2 min de análise para cada analito. O método multi-micotoxinas QuEChERS-LC-QToF-MS com o uso de calibração por superposição de matriz permite avaliar micotoxinas legisladas para verificar a adequação aos parâmetros regulatórios e gerar dados para apoiar o estabelecimento de limites máximos para uma gama maior de compostos a fim de proteger a saúde da população.

Mycotoxins are toxic compounds produced by filamentous fungi. Cereals are the most sensitive crops to fungal contamination and, consequently, to the presence of the mycotoxins. Mycotoxins can be transferred from contaminated malted barley to beer. In the literature, methods for malt or beer analysis have been optimized only for groups of structurally related mycotoxins, such as trichothecenes (deoxynivalenol, T2 and HT-2 toxins) and aflatoxins (B1, B2, G1 and G2), or just for Fusarium toxins. The objective of this study was to develop and validate a method for the simultaneous quantification of seventeen legislated [aflatoxins (B1, B2, G1 and G2), ochratoxin A (OTA), deoxynivalenol (DON), T-2 toxin, HT-2 toxin, fumonisin B1 (FB1) and zearalenone (ZEA)] and emerging mycotoxins [beauvericin (BEA), enniatins (A, A1, B and B1), moniliformin (MON) and sterigmatocystin (STG)] in malted barley and beer. The QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) approach was used in the sample preparation step, which was followed by liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-QToFMS). Matrix-matched calibration (MMC) was employed to overcome the matrix effect. The overall method performance was satisfactory to evaluate all the compounds in both matrices. The use of MMC curves was crucial to avoid the incorrect quantification of the analytes that showed a strong matrix effect: BEA (SSE: 105% for malt and beer) and ZEA (SSE: 165% and 120% for malt and beer, respectively) showed signal enhancement and DON (SSE of 32% and 15% for malt and beer, respectively) and MON (SSE: 29% and 15% for malt and beer, respectively) showed signal suppression. Analytical curves obtained with MMC showed adequate linearity and precision, with coefficients of determination (R2 ) higher than 0.99 for malt and beer and recoveries ranging from 72 to 102% for malt and from 73 to 100% for beer. The values of limit detection (LOD) (0.01-15 μg kg-1 for malt and beer) and limit quantification (LOQ) (0.05-50 μg kg-1 for malt and beer) showed that the method is sufficiently sensitive to determine the 17 mycotoxins. In addition, precision and sensitivity were in accordance with the different guidelines of method validation. Another advantage was the improved yield, requiring 1.2 min of analysis for each analyte. The QuEChERS-LC-QToF-MS multi-mycotoxin method using matrix- matched calibration allows the evaluation of legislated mycotoxins to verify compliance with regulatory parameters and generates data to support the establishment of limits for a wider range of compounds in order to protect the health of the population.