Metodologias para análise de experimentos de Dual RNA-seq: aplicação da melhor estratégia no estudo das interações entre Azospirillum brasilense e milho durante a inibição da produção de Ácido Indol-3-Acético pela planta

Abstract

Uma forma de elevar a produção vegetal sem aumentar a área plantada é através do uso de bactérias promotoras de crescimento vegetal. Entre essas bactérias estão as do gênero Azospirillum, encontradas na rizosfera de gramíneas e cereais, tanto em climas tropicais como em climas temperados. As principais características das bactérias desse gênero são a capacidade de fixar nitrogênio e a de produzir fitormônios, estimulando, assim, o crescimento das plantas. O presente estudo teve como objetivo melhorar a compreensão sobre a interação de Azospirillum e milho, em nível genético, em relação à ação do ácido indol-3-acético (AIA) nas plantas. Esse fitormônio é muito importante para o crescimento vegetal, principalmente através da estimulação da produção de raízes secundárias. Para esta finalidade, foi aplicado nas plantas o composto químico Yucasin [5-(4-chlorofenil) -4H-1,2,4-triazol-3-tiol], que é um potente inibidor de uma das enzimas da principal via de produção de AIA pelas plantas, a YUCCA. Plântulas de milho, inoculadas ou não com Azospirillum brasilense FP2, foram submetidas ao tratamento com Yucasin por 5 horas. Amostras de raízes de cada condição experimental foram utilizadas para a extração de RNA e para a construção das respectivas bibliotecas de cDNA. Uma vez que a metodologia utilizada foi de Dual RNA-seq, fez-se necessário o aprimoramento da forma de análise dos dados gerados após o sequenciamento das bibliotecas de cDNA, constituídas de amostras de RNA de ambos os organismos. Apesar de a maioria dos trabalhos de Dual RNA-seq utilizar a análise sequencial dos dados, a análise combinada, na qual se compara simultaneamente os dados, parece ser a mais indicada. Nesse tipo de análise, as bibliotecas são alinhadas contra um arquivo composto pelos genomas de ambos os organismos de forma concatenada, antes da etapa de mapeamento das sequências contra os respectivos genomas anotados. Para verificar a eficácia da metodologia combinada em relação à sequencial foram utilizadas bibliotecas de cDNAs disponíveis em bancos públicos e bibliotecas oriundas de um experimento prévio realizado em nosso laboratório. A metodologia sequencial atribuiu um número maior de sequências ao primeiro genoma utilizado (devido ao mapeamento cruzado) do que a metodologia combinada. Também, a quantidade de mapeamento cruzado foi menor na análise combinada do que na sequencial, evidenciando a importância da utilização da análise combinada em experimentos de Dual RNA-seq, a fim de se evitar a perda de informações, principalmente em relação ao organismo procariótico. A análise combinada foi aplicada para analisar as bibliotecas de cDNA do experimento Azospirillum-milho, na presença ou não de Yucasin. Com essa metodologia foi possível observar em milho genes diferencialmente expressos que codificam proteínas da via de resposta ao ácido abscísico (ABA) e fatores de transcrição evolvidos nas respostas a estresses bióticos e abióticos. Esses resultados indicam que a planta respondeu à presença da bactéria e do Yucasin. Dados fisiológicos mostraram que o AIA produzido pela bactéria foi suficiente para recuperar o fenótipo das plantas submetidas ao tratamento com Yucasin. Com relação à bactéria, foram identificados genes diferencialmente expressos que codificam proteínas que participam do transporte transmembrana e da biossíntese de terpenoides.

One way to increase crop yields without increasing planted area is through the use of plant growth-promoting bacteria. These include bacteria of the genus Azospirillum found in the grass and cereal rhizosphere in both tropical and temperate climates. The main characteristics of bacteria of this genus are the ability to fix nitrogen and to produce phytohormones, thus stimulating plant growth. The present study aimed to improve the genetic understanding of the interaction of Azospirillum and maize concerning the action of indole-3-acetic acid (IAA) on plants. This phytohormone is very important for plant growth, primarily through the stimulation of secondary root production. For this purpose, the chemical compound Yucasin [5-(4-chlorophenyl) -4H-1,2,4-triazol-3-thiol], which is a potent inhibitor of one of the enzymes (YUCCA) of the major plant production AIA pathway, was applied to the plants. Corn seedlings, inoculated or not with Azospirillum brasilense FP2, were submitted to treatment with Yucasin for 5 hours. Root samples from each experimental condition were used for RNA extraction and construction of the respective cDNA libraries. Since the methodology used was Dual RNA-seq, it was necessary to improve the analysis of the data generated after the sequencing of cDNA libraries, consisting of RNA samples from both organisms. Although most Dual RNA-seq works use sequential data analysis, combined analysis, in which data are simultaneously compared, seems to be the most appropriate. In this type of analysis, libraries are aligned against a file composed of the genomes of both organisms in a concatenated manner prior to the sequence mapping step against their annotated genomes. To verify the effectiveness of the combined methodology in relation to the sequential, we used libraries of cDNAs available in public banks and libraries from a previous experiment performed in our laboratory. The sequential methodology assigned more sequences to the first genome used (due to cross-mapping) than the combined methodology. Also, the amount of cross-mapping was lower in the combined than in the sequential analysis, evidencing the importance of using the combined analysis in Dual RNA-seq experiments, in order to avoid information loss, especially about the prokaryotic organism. The combined analysis was applied to analyze the cDNA libraries of the Azospirillum-maize experiment, with or without Yucasin. With this methodology, it was possible to observe in maize differentially expressed genes that encode abscisic acid (ABA) response pathway proteins and transcription factors involved in responses to biotic and abiotic stresses. These results indicate that the plant responded to the presence of bacteria and Yucasin. Physiological data showed that the AIA produced by the bacterium was sufficient to recover the phenotype of plants subjected to treatment with Yucasin. For bacteria, differentially expressed genes that encode proteins that participate in transmembrane transport and terpenoid biosynthesis were identified.