Análises transcritômicas em Cryptococcus gattii e seu impacto na definição de genes e outros elementos genômicos

Abstract

Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose, uma doença com cerca de 1 milhão de novos casos anuais e aproximadamente 625 mil óbitos. Embora a espécie irmã C. neoformans cause meningite criptocócica em indivíduos imunodeprimidos e seja a maior responsável pelo grande número de casos diagnosticados; C. gattii infecta indivíduos imunocompetentes causando infecção pulmonar. Neste contexto, C. gattii tem recebido crescente atenção desde o surto do Noroeste do Pacífico, tendo-se reunido esforços para identificar as variantes genéticas das linhagens que provocaram tal evento. Devido as diferenças entre genótipos, hipotetiza-se que a ausência da maquinaria do RNA de interferência seja um dos mecanismos causadores de mutação e consequente hipervirulência, já que as linhagens do genótipo VGII responsável pelo surto não possuem RNAi funcional; e mutantes de componentes do RNAi em C. neoformans podem apresentar tal fenótipo. Assim, teve este estudo o objetivo de (i) identificar a presença de retrotransposons – principais alvos da via do RNAi para a defesa da integridade genômica – em linhagens de C. gattii; (ii) avaliar a expressão de retrotransposons e a presença de sRNAs associados na linhagem R265 – representante hipervirulenta do subgrupo VGII; (iii) analisar o perfil metabólico da linhagem R265 durante infecção pulmonar em modelo murino de criptococose; e (iv) desenvolver uma pipeline automática de predição gênica otimizada e validada com C. neoformans, para aplicação em C. gattii R265. Como resultados, observou-se que linhagens do genótipo VGII apresentavam um menor número de sequências preditas de retrotransposons em seus genomas, quando comparadas a linhagens do VGI, a qual possui RNAi funcional. Além disso, pode-se inferir a presença de sRNAs associados a estas sequências, e a possível regulação das mesmas pela distribuição de sRNAs nas regiões LTR e regiões entre domínios. O perfil metabólico de C. gattii R265 durante a infecção murina, por sua vez, demonstrou a alta expressão de genes associados a vias de metabolismo de aminoácidos. Tais proteínas atuam na utilização de carbono e nitrogênio como fonte para geração de intermediários do metabolismo de carboidratos em um cenário de restrição de glicose imposto como sistema de defesa do hospedeiro. Por fim, o desenvolvimento de uma pipeline de predição gênica automatizada e otimizada resultou em um sistema com cerca de 70% dos genes codificantes de C. gattii R265 corretamente anotados.

Cryptococcus gattii is one of the etiologic agents of cryptococcosis, a disease with about 1 million new annual cases and approximately 625,000 deaths. Although sister species C. neoformans causes cryptococcal meningitis in immunocompromised individuals and is the major responsible for the large number of diagnosed cases; C. gattii infects immunocompetent individuals causing lung infection. In this context, C. gattii has received increasing attention since the Pacific Northwest outbreak, and efforts have been made to identify the genetic variants of C. gattii strains that caused such an event. Due to the differences between genotypes, it is hypothesized that the absence of interference RNA machinery is one of the mechanisms that cause mutation and consequent hypervirulence, since the genotypes of the VGII genotype responsible for the outbreak do not have a functional RNAi; and mutants of RNAi components in C. neoformans may exhibit such a phenotype. Thus, this study aimed to (i) identify the presence of retrotransposons - main targets of the RNAi pathway for the defense of genomic integrity - in C. gattii strains; (ii) evaluate the expression of retrotransposons and the presence of associated sRNAs in R265 strain - hypervirulent representative of subgroup VGII; (iii) analyze the metabolic profile of the R265 strain during lung infection in a murine model of cryptococcosis; and (iv) develop an automatic gene prediction pipeline, optimized and validated with C. neoformans for application on C. gattii R265. As a result, it was observed that VGII genotype strains presented fewer predicted retrotransposon sequences in their genomes when compared to VGI strains, which have functional RNAi. Furthermore, was possible to infer the presence of sRNAs associated with these sequences and their possible regulation by the distribution of sRNAs in LTR regions and regions between domains. The metabolic profile of C. gattii R265 during murine infection, in turn, demonstrated the high expression of genes associated with amino acid metabolism pathways. These proteins act on the use of carbon and nitrogen as a source for the generation of carbohydrate metabolism intermediates in a glucose restriction scenario imposed as a host defense system. Finally, the development of an automated and optimized gene prediction pipeline resulted in a system with about 70% of the correctly annotated C. gattii R265 coding genes.