Edição gênica em mucopolissacaridose tipo 1 utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Abstract

A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossômica de depósito (DLD) causada por mutações no gene da alfa-L-iduronidase (IDUA), enzima responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos dermatan e heparan sulfato. Os dois tratamentos disponíveis, terapia de reposição enzimática e transplante de células tronco hematopoiéticas, têm limitações importantes. Os sistemas de edição gênica que foram desenvolvidos nos últimos anos parecem ser alternativas promissoras para este tipo de doença. Entre eles, o sistema CRISPR-Cas9 tem se destacado. Descrito como uma forma de sistema imune de bactérias, ele foi adaptado para editar locais precisos do genoma humano e de outros eucariotos. O objetivo geral desta tese foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para a correção gênica em MPS I. No primeiro trabalho discutimos como a edição gênica pode ser aplicada no tratamento de diferentes DLD. Um dos principais fatores para que a modificação do DNA ocorra de forma eficiente é a entrega intracelular dos vetores em quantidade adequada. Para tanto, no segundo trabalho da tese, descrevemos um protocolo otimizado para transfecção de células tronco mesenquimais (CTM), que são células de difícil transfecção, com Lipofectamina® 3000. Utilizando CTM com poucas passagens, com aproximadamente 70 % de confluência e uma relação lipídeo/DNA de 3 μL/μg, obtivemos até 26 % de células transfectadas. O objetivo do terceiro trabalho da tese foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para corrigir in vitro uma das mutações mais comuns em pacientes com MPS I, responsável pelo fenótipo grave da doença. Fibroblastos humanos homozigotos para p.W402X foram transfectados e analisados por até um mês após o tratamento. A atividade de IDUA nas células transfectadas aumentou significativamente, houve uma diminuição no número e tamanho dos lisossomos, e o sequenciamento de nova geração mostrou que um percentual das células tratadas apresentava a sequência normal do gene da IDUA, confirmando que a mutação patogênica foi corrigida. São apresentados ainda resultados de um trabalho em andamento em que CRISPR-Cas9 e um vetor doador foram utilizados para inserir o cDNA completo da Idua em CTM extraídas de camundongos MPS I. Após seleção das células modificadas, a atividade enzimática alta mostrou que a sequência foi corretamente inserida. Os estudos desta tese são uma prova de conceito de que a edição gênica com CRISPR-Cas9 pode ser usada para correção de mutações responsáveis pela MPS I e abre a possibilidade de uso desta tecnologia como uma nova abordagem terapêutica em doenças de depósito lisossômico.

Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease caused by mutations in the alpha-L-iduronidase (IDUA) gene, which encodes the enzyme responsible for degradation of glycosaminoglycans dermatan and heparan sulfate. The two available treatments, enzyme replacement therapy and hematopoietic stem cells transplantation, have important limitations. The gene editing technologies that have been developed in recent years are promising alternatives for this type of disease. Among them, the CRISPR-Cas9 system has excelled. Described as a form of bacterial immune system, it has been adapted for editing genes in precise points of the human and other eukaryotes genomes. Thus, the overall objective of this thesis was to use the CRISPR-Cas9 system for gene correction in MPS I. In the first study, we discussed how gene editing can be applied to the treatment of different LSD. One of the main factors influencing success of DNA modification is the delivery of vectors in proper amount into the cells. Therefore, in the second work, we described an optimized protocol with Lipofectamine® 3000 for transfection of mesenchymal stem cells (MSC), which are known to be difficult to transfect cells. Using MSC with few passages, approximately 70 % of cell confluency, and a relationship lipid/DNA of 3 μL/μg, we could achieve up to 26 % of transfected cells. The purpose of the third work of this thesis was to use the CRISPR-Cas9 system to correct in vitro one of the most common mutations in MPS I patients, responsible for severe MPS I phenotype. Human fibroblasts homozygous for p.W402X were transfected and analyzed for up to a month after treatment. IDUA activity in transfected cells increased significantly, there was a decrease in the number and size of lysosomes, and next generation sequencing showed that a percentage of treated cells presented the normal sequence of IDUA gene, confirming that the pathogenic mutation was corrected. We also report results from a work in progress in which CRISPR-Cas9 and a donor vector were used to insert the complete Idua cDNA in MSC extracted from MPS I mice After selection of modified cells, the high enzyme activity showed that the sequence was properly inserted. The studies in this thesis are a proof of concept that gene editing with CRISPR-Cas9 can be used to correct mutations responsible for MPS I, and opens the possibility of using this technology as a new therapeutic approach in lysosomal storage diseases.