Novos elementos regulatórios da fixação biológica do nitrogênio em Paenibacillus riograndensis SBR5т

Abstract

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis SBR5T é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, interessante modelo para o estudo da regulação da FBN com o genoma completo disponível. O fator de transcrição GlnR foi proposto como regulador dos genes nif em Paenibacillus spp. a partir de análises in silico. O presente trabalho identificou sítios de ligação de GlnR em promotores de genes envolvido com a FBN e validou o papel de GlnR como regulador negativo dos genes nif em P. riograndensis. Também foi demonstrado que a enzima glutamina sintetase interage com GlnR quando está inibida por feedback e estabiliza a ligação de GlnR às regiões reguladoras dos genes nif. Um modelo de repressão baseado em operadores múltiplos foi proposto integrando a regulação da FBN à regulação global do nitrogênio exercida por GlnR. Na tentativa de identificar elementos específicos relacionados à regulação do molibdênio (componente do cofator enzimático) e da nitrogenase alternativa (com cofator independente de molibdênio), foi acessado o perfil transcricional de P. riograndensis sob condições de limitação de nitrogênio e molibdênio. Alguns fatores de transcrição especificamente induzidos sob tais condições e provavelmente relacionados à homeostase de metais foram identificados. Com relação à glutamina sintetase, além da demonstração da interação entre a enzima e o fator de transcrição GlnR, duas proteínas adicionais homólogas de glutamina sintetase e que não participam dessa regulação foram identificadas codificadas no genoma. Uma delas foi caracterizada como glutamina sintetase funcional, enquanto a outra não apresentou atividade bioquímica. Além disso, um protocolo para transformação da linhagem em estudo foi estabelecido e otimizado, o que permitirá aprofundar os estudos de genética molecular tanto da FBN como de outros processos de interesse em P. riograndensis.

Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gram-negative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis SBR5T is a Grampositive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. The transcription factor GlnR has been proposed as the nif regulator in Paenibacillus spp. based on in silico analysis. The present work identified GlnR-binding sites at BNFrelated promoters and validated GlnR role as nif negative regulator in P. riograndensis. It was also demonstrated that the feedback-inhibited glutamine synthetase enzyme interacts with GlnR and stabilizes its binding activity in the nif genes promoters. A multiple operator model was proposed to integrate BNF regulation and the global nitrogen regulation coordinated by GlnR. In an effort to identify specific regulatory elements related to molybdenum (enzymatic cofactor component) and the alternative nitrogenase (which presents a molybdenum-independent cofactor), the transcriptional profile of P. riograndensis was accessed under nitrogen and molybdenum limiting conditions. Transcription factors specifically induced under such conditions and probably related to metal homeostasis were identified. Regarding the glutamine synthetase, two additional glutamine synthetase homologs that do not take part in GlnR regulation were identified. One of them was characterized as a functional glutamine synthetase, while the other did not display biochemical activity. Also, a protocol to transform the model in study was established and optimized. This protocol allows the development of further molecular research to unveil BNF and other interesting processes in P. riograndensis.