Identificação e caracterização de pequenos RNAs não codificantes e genes alvos envolvidos em estresse abiótico (seca e salinidade) em Eugenia uniflora L. (Myrtaceae)

Abstract

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta.

Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.