Uso de plasmídeos vegetais para transferir resistência à Venturia inaequalis em cultivares de macieira (Malus x domestica)

Abstract

A macieira (Malus × domestica) possui importância mundial entre as frutíferas de clima temperado, e o Brasil se destaca entre os maiores produtores mundiais de maçã.À sarna da macieira, causada pelo fungo ascomiceto Venturia inaequalis, é uma das principais doenças nessa cultura. As duas cultivares mais consumidas no Brasil, Fuji e Gala, são altamente suscetíveis à sarna. O gene Vf2, derivado do clone 821 da espécie silvestre Malus floribunda, é capaz de conferir resistência à doença. O processo de melhoramento genético da macieira e a introgressão de novos genes derivados de germoplasma é um processo demorado e difícil devido ao longo tempo de geração das plantas e à autoincompatibilidade à autopolinização em Malus.Historicamente a introgressão recombinante de genes em vegetais baseou-se na transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Porém, novas técnicasestão sendo estabelecidas e vem revolucionado o campo da genômica funcional em plantas como a utilização de DNA epissomal em plasmídeos vegetais derivados de vírus. Estes vetores não se integram ao genoma da planta hospedeira e não são herdáveis. Os vetores consistem de vírus modificados capazes de espalhar-se por todos os tecidos da planta tratadasem causar doença e levando à expressão de genes de interesse sem a necessidade de obtenção de plantas transgênicas. Este trabalho tevecomo objetivo transferir a resistência aV. inaequalis, conferida pelo gene Vf2, para as cultivares de macieira Fuji e Gala, utilizando-seplasmídeos vegetais baseado nos vírus TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus). O gene de resistência Vf2 derivado de Malus floribunda 821 foi clonado nosvetores de expressão e injetadoem plantas de macieira das cultivares Maxi Gala e Fuji Suprema.O DNA plasmidial foi detectado sistemicamente nas plantas tratadas e este se manteve estável durante os8 meses de testes. A expressão do gene Vf2 foi quantificada por RT-qPCR e diversas plantas apresentaram níveis elevados de expressão deste gene de resistência. Estas plantas foram desafiadas com esporos de V. inaequalis e a maioria das plantas tratadas apresentou fenótipo resistente à sarna. A introgressão recombinante baseada em plasmídeos vegetais demonstrou ser eficaz em transferir material genético de forma sistêmica nas duas cultivares de macieira testadas. O vetor plasmidial foi detectado nas plantas tratadas durante todo o período(8 meses) avaliado neste estudo, e a expressão do gene de resistência foi detectada em diversos indivíduos. Nosso estudo reforça a aplicabilidade desta técnica em plantas lenhosas perenes e abre a possibilidade para a introgressão rápida de outras características de interesse derivadas da expressão heteróloga de genes com potencial biotecnológico.

Apple (Malus x domestica) is an important crop among temperate fruit trees, and Brazil features among the world’s biggest apple producers. The apple scab, caused by the ascomycete fungus Venturia inaequalis, is a major disease of the culture. The two most consumed cultivars in Brazil, Fuji and Gala, are highly susceptible to apple scab. The Vf gene, derived from clone 821 of the wild species Malus floribunda, is capable of conferring resistance to the scab disease. The genetic improvement process of apple by introgression of new genes derived from germplasm is lenghty due to long generation time and self-incompatibility. Historically the recombinant introgression of genes in plantshas been based on genetic transformation emplyingAgrobacterium tumefaciens. However, new techniques have been developed and are revolutionizing plantfunctional genomics such as virus-derived plant episomalplasmids.These vectors do not integrate in to thehost plant genome and are not inheritable. The vectors consist of a modified virus capable of spreading to all tissues of thetreated plant without causing disease and leading to the systemic expression of the gene of interest without the need of obtaining transgenic plants.This workaimed to transfer the resistance against V. inaequalis, granted by the Vf2 gene, to Fuji and Gala apple suceptible cultivars, by using plant plasmids based on TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl virus).The resistance gene Vf2 derived from Malus floribunda 821 was cloned on expression vectors and injectedto Maxi Gala and Fuji Supremaplants.The plasmid DNA was systemically detected on treated plants and remained stable for at least8 months.The expression of theVfgene was quantified by RT-qPCR and several plants presented high levels of Vf2expression. These plants were challenged by spores of V. inaequalis and the majority of the treated plants displayed scab resistant phenotypes.The Vf2introgression based on plant plasmidswas shown to be effective on transferring genetic material sistemically to the apple cultivars tested. The plasmids weredetected on treated plants during the whole evaluated time of this study (8 months), and the resistance gene expression was detected on several individuals. Our study reinforces the applicability of such technique in woody perennial plants and givesthe possibility for fast introgression of other characteristics of interest dependent on genes with diverse biotechnological potential.