Anotação da família WRKY de soja [Glycine max (L.) Merril] e caracterização funcional de genes envolvidos na resposta a Phakopsora pachyrhizi, agente causador da ferrugem asiática

Abstract

Fatores de transcrição WRKY de soja têm sido identificados e relacionados em resposta a estresses bióticos e abióticos. No entanto, em estudos anteriores, a família WRKY estava subestimada. Recentemente, o envolvimento dos genes WRKY em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador de uma importante doença da soja, a Ferrugem Asiática, foi sugerido a partir de análise de dados de expressão gênica global. No presente estudo, a anotação completa da família WRKY de soja e a análise funcional de genes envolvidos na resposta à infecção por P. pachyrhizi foram realizada. A partir de buscas em bancos de dados do genoma da soja, genes WRKY foram anotados e aqueles envolvidos na resposta a P. pachyrhizi foram identificados usando quatro experimentos de expressão gênica global: superSAGE, RNA-Seq de lesões microdissecadas e dois microarranjos. O padrão de expressão gênica foi confirmado por RT-qPCR para oito genes. Embriões somáticos de soja foram transformados, visando a superexpressão ou silenciamento gênico, e plantas transgênicas foram desafiadas com P. pachyrhizi. Cento e setenta e oito genes WRKY foram anotados e 74 identificados como diferencialmente expressos durante a infecção pelo fungo. Em resposta a P. pachyrhizi, oito genes apresentaram expressão mais inicial e⁄ou mais forte no genótipo resistente quando comparado com o suscetível. Todos os oito genes analisados mostraram o pico de expressão nas primeiras 24 horas após a inoculação. Comparando a mineração de dados em resposta à infecção por P. pachyrhizi com o resultado do cladograma, um padrão de expressão similar pode ser observado em genes relacionados. Plantas superexpressando Glyma15g00570 não foram recuperadas. Provavelmente a expressão constitutiva deste gene afeta a regeneração das plantas. A participação de quatro genes homólogos em resposta ao patógeno foi demonstrada usando a técnica de RNAi. Quando infectada por P. pachyrhizi, folhas da linhagem silenciada mostraram maior número de lesões do que plantas não-transformadas. Em conclusão, neste trabalho a família WRKY de soja completa foi anotada e a participação de alguns membros em resposta a P. pachyrhizi foi demonstrada.

Soybean WRKY transcription factors have been identified and related with the response to biotic and abiotic stresses. However the soybean WRKY family was underrepresented in previous studies. Recently, the involvement of WRKY genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of an important soybean disease - Asian Soybean Rust (ASR)- has been suggested by the analyses of global geneexpression data. In the present study a genome-wide annotation of soybean WRKY family and the functional analyzes of genes involved in response to P. pachyrhizi were performed. Following a search in the soybean genomic databases, WRKY-encoding genes were annotated and those involved in response to P. pachyrhizi were identified using global gene-expression experiments: superSAGE, RNA-Seq of microdissected lesions and two microarrays. Gene expression pattern was validated by RT-qPCR. Soybean somatic embryos were transformed aiming WRKY overexpression or silencing, and transgenic plants were challenged with P. pachyrhizi. One hundred-seventy-eight WRKY genes were annotated and 74 identified as differentially expressed during fungus infection. In response to P. pachyrhizi, eight genes were expressed earlier and⁄or stronger in a resistant genotype when compared to a susceptible one. All the eight analyzed genes showed the expression peak at the first 24 hours after inoculation. By comparing data mining in response to P. pachyrhizi infection with the clustering result, similar expression pattern could be observed in closely related genes. Plants overexpressing Glyma15g00570 were not recovered. Probably the constitutive overexpression of the gene may affect the regeneration of plants. The participation of four homologous genes in response to pathogen was demonstrated using RNAi approach. When infected by P. pachyrhizi, leaves of silenced transgenic line showed higher number of lesions than wild-type plants. In conclusion, the complete soybean WRKY family was annotated and the participation of some members in response to P. pachyrhizi was demonstrated.