Obtenção de plantas estavelmente transformadas pelo sistema integrado bombardeamento /Agrobacterium e análise funcional dos genes que codificam as ureases estruturais da soja

Abstract

As urease de plantas catalisam a hidrólise da ureia e apresentam efeitos tóxicos a fungos patogênicos e insetos fitófagos. Em soja [Glycine max L. Merrill] foram descritas duas ureases estruturais: a embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, e a ubíqua, codificada pelo gene Eu4. Sabe-se que a urease embrião-específica purificada apresenta efeito inibitório sobre o crescimento in vitro de fungos filamentosos e desenvolvimento de insetos. A urease ubíqua é responsável pela reciclagem de toda a ureia proveniente do metabolismo, mas não há informações sobre seu envolvimento no sistema de defesa das plantas. A transformação genética é uma ferramenta importante em estudos de genômica funcional e, portanto, a disponibilidade de sistemas eficientes é um pré-requisito essencial. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas estavelmente transformadas a partir de embriões somáticos de soja submetidos ao sistema integrado bombardeamento/Agrobacterium, bem como a identificação e caracterização funcional dos genes que codificam as ureases estruturais de soja, especialmente a urease ubíqua em relação aos processos de resposta a fungos patogênicos. Inicialmente, testamos a eficiência de transformação de embriões somáticos secundários por um método que combina o bombardeamento de partículas livres de DNA com o sistema Agrobacterium. Plantas transgênicas férteis foram regeneradas de vários experimentos independentes de transformação utilizando diferentes plasmídios. Posteriormente, foi realizada a caracterização dos genes que codificam ureases presentes no genoma da soja. O gene Eu4 apresentou um padrão de expressão diferencial para genótipos suscetível e resistente ao longo do período de infecção por Phakopsora pachyrhizi, o agente etiológico da ferrugem asiática. Plantas transgênicas foram geradas visando a superexpressão de Eu4. Contudo, apenas uma planta apresentou níveis aumentados de expressão desse gene, enquanto que as demais plantas apresentaram o fenômeno de co-supressão dos genes endógeno e transgene. Avaliou-se o crescimento vegetativo dos fungos Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii e Penicillium herguei em meio de cultura contendo extrato protéico bruto de plantas transgênicas expressando maiores e menores níveis de urease e de plantas não-transgênicas. O crescimento dos fungos foi inversamente proporcional a quantidade da urease presente no extrato protéico das plantas. Quando infectadas por uredósporos de P. pachyrhizi, folhas destacadas das plantas co-suprimidas desenvolveram um número significativamente maior de lesões, pústulas e pústulas abetas do que folhas com níveis normais da enzima. Em conjunto estes resultados indicam um 15 importante envolvimento da urease ubíqua da soja na resposta à infecção da planta por fungos patogênicos. Além disso, um terceiro gene que codifica urease foi encontrado no banco de dados com a sequência completa do genoma da soja. O gene foi denominado Eu5 e seu produto SBU-III. A análise filogenética mostra que SBU-III está fortemente relacionada à isoforma embrião-específica. Apesar da grande similaridade na seqüência primária da proteína, SBU-III apresenta uma mutação em um aminoácido altamente conservado entre as ureases, sugerindo ausência da atividade ureolítica. O padrão de expressão do gene Eu5 em diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento foi determinado por RT-qPCR. Transcritos foram detectados em sementes um dia após a quebra de dormência, em raízes de plantas jovens e em embriões em desenvolvimento. As evidências sugerem que SBU-III não está envolvida na disponibilização de nitrogênio para as plantas, mas esta pode ter função de defesa.

Plants ureases catalyze urea hydrolysis and display toxic effects against pathogenic fungi and phytophagous insects. For soybean [Glycine max L. Merrill] two structural ureases have been described: the embryo-specific, encoded by Eu1 gene, and the ubiquitous, encoded by Eu4 gene. The toxic property of purified embryo-specific urease against filamentous fungi and insects was demonstrated in vitro. The ubiquitous urease is responsible for recycling all metabolically-derived urea, but there were no information about its putative defense role. Plant genetic transformation offers significant advancement in functional genomics. Therefore an efficient transformation system is required. This study aims to obtain stable transformed plants derived from somatic embryos submitted to the integrated bombardment/ Agrobacterium system, as well as identify and functionally characterize the soybean structural urease-encoding genes, specially the ubiquitous urease gene response to fungi. First, the transformation of soybean proliferating somatic embryos by a procedure that combines DNA-free particle bombardment and Agrobacterium was evaluated. Transgenic fertile plants were recovered from many transformation experiments using different plasmids. After, a study of ureases enconding genes present in the soybean genome was carried out. In the present work, Eu4 gene showed a differential expression pattern in susceptible and resistant genotypes over the course of Phakopsora pachyrhizi infection, the Asian rust causal agent. Transgenic plants aiming Eu4 overexpression were obtained. However, a single transgenic plant exhibited Eu4 overexpression, whereas the other ones showed co-suppression of endogenous and transgenes urease genes. The growth of Rhizoctonia solani, Phomopsis sp., Fusarium solani, Colletotrichum gossypii and Penicillium herguei in media containing crude protein extract from either transgenic or non-transgenic leaves was evaluated. Fugal growth was inversely proportional to ubiquitous urease amount in plant crude extracts. When infected by P. pachyrhizi uredospores, detached leaves of co-suppressed plants developed a significantly higher number of lesions, pustules and erupted pustules than leaves containing normal levels of the enzyme. These results suggested an important role of soybean ubiquitous urease in plant response against fungal infection. Furthermore, by searching the completed soybean genome sequence, a third urease-encoding locus was identified. The gene was designated Eu5 and its product, SBU-III. Phylogenetic analysis shows that SBU-III is closely related to the embryo-specific isoform. Although a high similarity in amino acid sequence was observed, a mutation in a highly conserved residue suggests absence of ureolytic activity. Expression profile of Eu5 gene in different organs and developmental stages was determined by RT-qPCR. Transcripts were detected in seeds one day after dormancy break, roots of young plants and embryos of developing seeds. Evidences suggest that SBU-III may not be involved in nitrogen availability to plants, but a defense role was proposed.