Seleção de oligonucleotídeos iniciadores visando compor um arranjo de sondas de DNA que identifique estirpes de pectobactérias

Abstract

A diferenciação entre espécies e subespécies de pectobactérias e outras bactérias fitopatogênicas é feita, basicamente, por testes bioquímicos e fisiológicos. Através de arranjos, macro e micro, de sondas de DNA, uma matriz, semelhante á gerada pelos resultados dos testes bioquímicos e fisiológicos, poderia ser construída e utilizada na identificação das estirpes. Para isto, há a necessidade da seleção de sondas de características a nível de gênero, espécie e subespécie. Como as sondas são obtidas por PCR, o objetivo desta pesquisa foi selecionar oligonucleotídeos iniciadores baseados em características fenotípicas e genotípicas. A maioria dos oligonucleotídeos iniciadores selecionados gerou produto, diferindo o padrão de amplificação entre os oligonucleotídeos iniciadores e entre as espécies ou subespécies de pectobactérias. Alguns não produziram fragmentos e outros geraram muitos produtos inespecíficos. Os oligonucleotídeos iniciadores 149LF/L1r amplificaram o DNA de todas as Pectobacterium spp., enquanto Y1/Y2 amplificaram o DNA apenas da espécie P. carotovorum. ADE1/ADE2 gerou produto apenas com a espécie P. chrysanthemi. Y45/Y46 e ECA1F/ECA1R são específicos para a subespécie P. carotovorum subsp. atrosepticum. Outros oligonucleotídeos iniciadores amplificam o DNA de alguns indivíduos dentro da espécie ou subespécie, como RdgF/RdgR e PnlF/PnlR com P. carotovorum, Br1F/L1R e HrpNF/HrpNR com P. caratovorum subsp. brasiliensis e CytR-RdF/CytR-BR com P. carotovorum subsp. atrosepticum. A análise do coeficiente de similaridade da matriz gerada mostrou uma alta similaridade entre as estirpes de cada subespécie, com exceção de P. carotovorum subsp. carotovorum que mostrou uma alta variabilidade. Estes resultados indicam que esta estratégia gera uma matriz que pode ser utilizada no cálculo do coeficiente de similaridade e auxiliar na identificação de estirpes de pectobactérias.

The differences among species and subspecies of pectobacteria and other phytopathogenic bacteria are identified mainly by biochemical and physiological methods. Through arrays (macro and micro) of DNA probes, a matrix, similar to one generated by the results of biochemical and physiological tests, could be built and used to identify strains. To accomplish this, it is necessary to choose probes associated to characteristics at genus, species and subspecies levels. As probes are obtained by PCR, the objective of this research was to select primers based on phenotypic and genotypic traits. Most selected primers amplified the bacterial DNA, giving a distinct pattern to species and subspecies. However, some primers produced no bands or non-specific ones. Primers 149LF/L1r amplified DNA from all Pectobacterium spp., while ADE1/ADE2 generated band only with the DNA of P. chrysanthemi. Y45/Y46 and ECA1F/ECA1R are specific to P. carotovorum subsp. atrosepticum. Other primers amplified DNA of some strains inside of a specific species or subspecies: RdgF/RdgR and PnlF/PnlR to P. carotovorum, Br1F/L1R and HrpNF/HrpNR to P. carotovorum subsp. brasiliensis, and CytR-RdF/CytR-BR to P. carotovorum subsp. atrosepticum. The analysis of the similarity coefficient of the matrix revealed a high level of similarity among the strains of each subspecies, with the except to P. carotovorum subsp. carotovorum. These results indicate that this strategy can be used to create a matrix for the calculation of a similarity coefficient which could be used to identify all major strains of pectobacteria.