Otimização da liberação e captação de enzimas lisossômicas superexpressas por células recombinantes microencapsuladas

Abstract

As doenças lisossômicas (DL) são um grupo de doenças herdadas geneticamente e que são causadas por um defeito parcial ou total de enzimas envolvidas na degradação de macromoléculas dentro dos lisossomos. Terapias para aumentar os níveis de enzima nas DL incluem o transplante de célulastronco hematopoiéticas (TCTH) e terapia de reposição enzimática (TRE). Esses tratamentos são todos baseados na propriedade das enzimas lisossomais de serem secretadas e captadas pelas células vizinhas através do receptor de manose-6-fosfato (M6PR). Novas abordagens terapêuticas vêm sendo investigadas, uma vez que as terapias atuais possuem limitações. A microencapsulação de células geneticamente modificadas superexpressando um produto terapêutico e o aperfeiçoamento na captação de enzimas lisossomais, via M6PR, parecem ser estratégias promissoras. Neste trabalho objetivamos aperfeiçoar o sistema de liberação de enzimas lisossomais superexpressas por células recombinantes microencapsuladas para o tratamento das DL. Para isso, estudos de biocompatibilidade in vivo foram avaliados com distintos tipos celulares (BHK e HepG2), concentrações de alginato (1 e 1,5%), tempos (7 e 21 dias) e sítios de implante (cavidade peritoneal, tecido subcutâneo e músculo vasto-medial) em ratos Wistar. A resposta inflamatória foi caracterizada e células-tronco mesenquimais (CTM) foram encapsuladas e implantadas em ratos para avaliar se o seu efeito imunomodulador poderia diminuí-la. Posteriormente o efeito antiinflamatório da prednisolona foi avaliado em camundongos normais e MPS I tratados com células BHK superexpressando IDUA (BHKIDUA) encapsuladas e implantadas na cavidade intraperitoneal por 15 dias. A liberação da enzima após implante foi avaliada por meio da recuperação das cápsulas e cultivo das mesmas por 24h e medida de IDUA no meio. Observamos que as microcapsulas in vivo provocam uma reação do tipo corpo estranho, em todos os parâmetros avaliados. Essa reação se dá por presença de fibrose e infiltrado inflamatório e diminui aos 21 dias. O uso de CTM encapsuladas melhorou esse aspecto, uma vez que a resposta foi menor em ratos nos quais esse tipo celular foi implantado, devido ao efeito imunomodulador dessas células. O tratamento com antiinflamatório prednisolona também diminuiu a resposta inflamatória gerada contra as microcápsulas implantadas na cavidade peritoneal de camundongos normais e MPS I. As células encapsuladas permaneceram viáveis após os 15 dias de implante. A liberação de enzima para o meio extracapsular é maior nas cápsulas recuperadas de animais tratados com prednisolona. Níveis de atividade de IDUA circulante passaram de indetectáveis para 2,4 nmol/h/mL de soro nos animais MPS I tratados. Outra estratégia utilizada foi a superexpressão de M6PR para melhorar a captação enzimática. Avaliamos os níveis de M6PR em fibroblastos de pacientes com Leucodistrofia Metacromática (LDM) e normais após o tratamento com o sobrenadante de células BHK superexpressando ARSA (BHKARSA), por imunocitoquímica e PCR em Tempo Real. Finalmente foi avaliado se o pré-tratamento de fibroblastos MPS I com o sobranadante de BHKARSA e posterior tratamento com o sobrenadante de BHKIDUA melhorava a captação de IDUA nessas células devido ao aumento na expressão dos M6PR. O tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA levou a um aumento na expressão, em cerca de 2 vezes, dos M6PR em fibroblastos de pacientes com LDM e de indivíduos normais. O pré-tratamento com o sobrenadante de células BHKARSA também levou a um aumento de 2 vezes na expressão dos M6PR e aumentou a captação de IDUA por fibroblastos de pacientes com MPS I. Juntos esses resultados sugerem que as células microencapsuladas podem ser uma boa estratégia para a entrega de produtos terapêuticos desde que sua biocompatibilidade seja melhorada e que a partir da descoberta dos mecanismos que levam à superxpressão dos M6PR, o sobrenadante de BHKARSA poderá ser usado como adjuvante no tratamento com TRE ou células encapsuladas.

Lysosomal Diseases (LD) are a group of genetically inherited diseases, caused by total or partial failure of enzymes involved in the degradation of macromolecules in lysosomes. Therapies to increase enzyme levels in LD include transplantation of hematopoietic stem cells (THSC) and enzyme replacement therapy (ERT). These treatments are based on the properties of lysosomal enzymes to be secreted and uptaken by neighboring cells through the mannose 6-phosphate receptor (M6PR). Since current therapies have limitations, new therapeutic approaches are under investigation. Microencapsulation of genetically modified cells overexpressing therapeutic products and the improvement in the uptake of lysosomal enzymes via M6PR seem to be promising strategies. In this work, we aimed to improve the delivery system of lysosomal enzymes overexpressed by microencapsulated recombinant cells for LD treatment. In vivo biocompatibility was evaluated using distinct cell lines (BHK and HepG2), alginate concentrations (1 and 1.5%), duration (7 and 21 days), and implant sites (peritoneal, subcutaneous and in the vastus medialis muscle) in Wistar rats. Inflammatory response was observed and characterized. Then we used encapsulated mesenchymal stem cells (MSC) to evaluate whether their immunomodulatory effect could decrease this response in rats. Subsequently, the anti-inflammatory effect of prednisolone was evaluated in normal and MPSI mice, both treated with encapsulated BHK cells overexpressing IDUA (BHKIDUA) and implanted in intraperitoneal cavity for 15 days. The enzyme release to the extra-capsular medium was measured in recovered capsules after 24h culture. The in vivo biocompatibility of microcapsules is a typical foreign body reaction in all parameters evaluated. This reaction occurs due to fibrosis and inflammatory infiltrate formation, but decreases after 21 days. The use of encapsulated MSC improved this aspect, since the response was milder in rats that received this cell type, due to the immonomodulatory effect of MSC. Treatment with prednisolone also decreased the response generated against alginate microcapsules implanted in the peritoneal cavity of both normal and MPS I mice. The encapsulated cells remained viable 15 days after the implant. The enzyme release to the extracapsular medium was higher in capsules recovered from prednisolone treated animals. Circulating levels of IDUA increased from undetectable to 2.4 nmol/h/mL of serum. Another strategy evaluated by our group was the up regulation of M6PR to enhance enzyme uptake. We evaluated M6PR levels in MLD and normal fibroblasts after treatment with the conditionated medium from cells overexpressing ARSA (BHKARSA), by immunocytochemistry and real time PCR. Finally we verified if pre-treatment of MPS I fibroblasts with BHKARSA followed by treatment with conditionated medium of BHKIDUA improved IDUA uptake. MLD and normal fibroblasts treated with BHKARSA had a 2-fold increase in M6PR expression. Pre-treatment with BHKARSA and after with BHKIDUA also led to a 2-fold increase in the expression of M6PR, and IDUA uptake was improved in these cells. Together these results suggest that microencapsulated cells may be an interesting strategy for delivery of therapeutic products as long as its biocompatibility is improved. Once the mechanism leading to M6PR over expression is defined, the conditionated medium of BHKARSA could be used as an adjuvant in ERT or with encapsulated cells.