Caracterização de cistatinas e possíveis funções na fisiologia do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Abstract

Cistatinas constituem uma família de inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases, estando envolvidas em diversos processos fisiológicos nos carrapatos. Contudo, até o momento, existem poucos trabalhos com cistatinas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, carrapato responsável por prejuízos na pecuária em diversos países. Nesse trabalho, foi analisado as sequências, o perfil transcricional, a localização tecidual, a afinidade por catepsinas, a antigenicidade e a imunogenicidade de prováveis cistatinas de R. microplus. As cinco sequências nucleotídicas analisadas contêm regiões codificadoras para os motivos característicos das cistatinas, além dos resíduos de cisteínas e o peptídeosinal pertencentes a esse grupo de inibidores. O perfil transcricional dos genes de cistatinas e a análise sorológica das cistatinas nativas detectaram diferentes níveis da presença desses inibidores em tecidos de ovo, larva, intestino, glândulas salivares, ovário e corpo gorduroso do carrapato. Três cistatinas foram expressas em Escherichia coli, sendo posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade. Duas dessas cistatinas recombinantes apresentaram afinidades distintas para as catepsinas B, C e L, sugerindo o seu papel fisiológico diferencial durante o metabolismo do sangue ingerido e formação do ovo do carrapato, e também na modulação do sistema imune do hospedeiro. Através de análises in silico, regiões antigênicas das sequências de aminoácidos desses inibidores mostraram similaridade (54-92 %) com cistatinas homologas de Rhipicephalus spp., o que torna estas cistatinas de R. microplus possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas multiespécies. A imunogenicidade das cistatinas recombinantes foi evidenciada por análises in silico e sorológicas, apresentando uma reatividade cruzada entre as cistatinas através de epitopos comuns. Esses resultados ajudam a esclarecer o papel das cistatinas na fisiologia do R. microplus, e, assim, gerarem conhecimento para auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle desse parasito.

Cystatins belong to a family of tight-binding and reversible inhibitors of cysteinepeptidases. In ticks, these inhibitors are involved in a diversity of physiologic processes. At present, however, cystatins from Rhipicephalus (Boophilus) microplus, tick responsible for significant economic losses in livestock, are poorly characterized, limiting the elucidation of their physiological role and vaccine potential. Therefore, we investigated the sequences, tissue localization, enzyme targets and immunogenic properties of putative cystatins from R. microplus. The five nucleotide sequences analyzed encode the three cystatin motifs, cysteine residues and secretory signal peptides characteristic of these inhibitors, highly conserved. Transcription profiles and native protein expression analysis revealed differential gene transcription and protein expression patterns among cystatins in egg, larva, gut, salivary glands, ovary, and fat body tissues. Three cystatins were produced in the recombinant form in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Two of these cystatins showed distinct affinities to cathepsins B, C, and L, which are involved in tick and host physiological processes, suggesting cystatin role during tick blood digestion, egg development and host-immune system modulation. Furthermore, by in silico analysis, antigenic amino acid regions from these inhibitors showed a degree of homology of 54 to 92 % among Rhipicephalus spp. cystatins, suggesting the use of R. microplus cystatin in a multi-specie vaccine. Antigenicity and immunogenicity of the recombinant cystatins were determined by in silico and serological analysis, indicating cross-reactivity between cystatins in shared epitopes. Taken together, these results shed light of cystatins role in R. miroplus physiology, improving knowledge to the development of new vector control strategies.