Estudo da influência de polimorfismos do gene do receptor D4 de dopamina (DRD4) sobre a etiologia e manifestações clínicas do Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH)

Abstract

O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos psiquiátricos mais comuns da infância e adolescência, caracterizado por sintomas de desatenção, hiperatividade e impulsividade. É uma doença bastante complexa, com uma herdabilidade estimada de 76%. A maioria dos estudos moleculares com o TDAH teve como alvo genes codificadores de componentes do sistema dopaminérgico. Entre esses, o gene do receptor D4 de dopamina (DRD4) é o loco mais investigado, sendo considerado um gene de suscetibilidade ao TDAH. Entretanto, ainda existem resultados conflitantes. O objetivo do presente estudo foi contribuir para um maior esclarecimento acerca da participação do gene DRD4 na etiologia e nas manifestações clínicas do TDAH. Para tanto, a hipótese de associação do TDAH com o gene DRD4 foi testada através do estudo de quatro polimorfismos: a duplicação de 120 pb e os SNPs -616C>G (rs747302) e -521C>T (rs1800955), todos localizados na região promotora, e o VNTR de 48 pb do exon 3. A amostra foi obtida junto ao Programa do Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (ProDAH/HCPA) e em escolas públicas de Porto Alegre, consistindo de 478 crianças e/ou adolescentes com TDAH, diagnosticados de acordo com os critérios do DSM-IV, e seus pais biológicos. Os polimorfismos do gene DRD4 foram genotipados por PCR convencional seguido de clivagem com endonuclease de restrição quando necessário. A hipótese de associação foi testada por métodos baseados em famílias (Transmit e FBAT) e através de análises dimensionais (PBAT e ANOVA), tanto para cada polimorfismo isoladamente como em haplótipos, tendo-se estimado o desequilíbrio de ligação (DL) entre os polimorfismos estudados (MLocus). Através do método baseado em famílias, nenhuma das três variantes da região promotora foi associada ao TDAH, seja na amostra clínica total ou em subgrupos de pacientes definidos por diferentes características clínicas (valores de P entre 0,139 e 1). Em relação ao VNTR, houve evidência de associação entre o TDAH e o alelo 2R: observou-se um déficit de transmissão desse alelo dos pais para a prole, através de ambos os programas Transmit e FBAT (valores de P de 0,031 e 0,032, respectivamente), no subgrupo de pacientes do tipo combinado, o que sugere um efeito protetor para esse alelo. Foi detectado um excesso de transmissão do alelo 4R nesse mesmo subgrupo (P=0,017) e no grupo de pacientes que apresentavam as comorbidades transtorno de oposição desafio (TOD) e/ou transtorno de conduta (TC) (P=0.036), ambos através do Transmit, sugerindo um novo alelo de risco na nossa amostra. Esses achados não foram significantes ao se aplicar o FBAT (valores de P de 0,076 e 0,134, respectivamente). As análises dimensionais realizadas não revelaram qualquer associação com nenhum polimorfismo (valores de P entre 0,073 e 0,992). Da mesma maneira, o estudo de haplótipos não teve resultados positivos (valores de P entre 0,234 e 0,981). Houve uma forte evidência de DL entre a duplicação de 120 pb (polimorfismo de posição 5’ mais extrema) e o VNTR de 48 pb (P≤0,001/ D’=0,425 entre o alelo não-duplicado e 2R e P≤0,001/ D’=0,521 entre o alelo duplicado e 7R), mas não entre esses marcadores e os SNPs -616C>G e -521C>T. resultados que confirmam uma estrutura gênica bastante complexa. Embora atípicos, uma vez que o alelo 7R é o considerado de risco pela literatura, nossos achados são plausíveis. É possível que alelos diferentes confiram risco ou proteção ao TDAH em populações diversas. Entender a estrutura e função do gene DRD4 e então estudar sua associação com o TDAH, usando fenótipos definidos através de diferentes abordagens (como, por exemplo, endofenótipos) e diferentes métodos de análise podem ser estratégias mais produtivas do que as empregadas até o momento para elucidar a verdadeira contribuição do loco DRD4 a essa doença.

Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is one of the most common psychiatric disorders of childhood and adolescence, characterized by symptoms of inattention, hyperactivity and impulsivity. It is a very complex disease, with an estimated heritability of 76%. The majority of molecular studies with ADHD had as targets dopaminergic system encoding genes. Among these, dopamine D4 receptor gene (DRD4) is the most investigated locus, being considered an ADHD susceptibility gene. However, there are some conflicting results. The aim of the present study was to contribute to a better understanding of DRD4 role on ADHD etiology and its clinical manifestations. For this, association hypothesis was tested through the study of four polymorphisms: 120 bp tandem duplication, -616C>G (rs747302) and -521C>T (rs1800955) SNPs, all located at promoter region, and 48 bp VNTR of exon 3. The sample was obtained at Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder Program of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (ProDAH/HCPA) and from public schools from Porto Alegre, consisting of 478 children and/or adolescents with ADHD, diagnosed according to DSM-IV criteria, and their biological parents. The polymorphisms were genotyped through conventional PCR followed by restriction endonuclease cleavage when necessary. Association hypothesis was tested by family-based methods (Transmit and FBAT) and through dimensional analyses (PBAT and ANOVA), for each isolated polymorphism as well as for haplotypes, with linkage disequilibrium (LD) estimated between the studied polymorphisms (MLocus). Using family-based methods, none of the three promoter region variants were associated with ADHD, for either total clinical sample or subgroups of patients defined according to different clinical characteristics (P values ranging from 0.139 to 1). For the VNTR, there was evidence of association between ADHD and 2R allele: it was observed a transmission deficit of this allele from parents to offspring, by both Transmit and FBAT softwares (P values of 0.031 and 0.032, respectively) in the group of combined subtype patients, what suggests a protective effect of this allele. An excess of 4R allele transmission was detected in this same subgroup (P=0.017) and in the group of patients presenting oppositional defiant disorder (ODD) and/or conduct disorder (CD) (P=0.036), with Transmit, suggesting a new risk allele in our sample. These findings were not significant when applying FBAT (P values ranging from 0.076 to 0.134, respectively). Dimensional analyses performed did not reveal association with any polymorphism (P values ranging from 0.073 to 0.992). Haplotype study also did not show positive results (P values ranging from 0.234 to 0.981). There was strong evidence of LD between 120 bp tandem duplication (the most 5’UTR investigated polymorphism) and 48 bp VNTR (P≤0.001/ D’=0.425 between non-duplicated allele and 2R and P≤0.001/ D’=0.521 between duplicated allele and 7R), but not between these markers and -616C>G and -521C>T polymorphisms, results that support a very complex genetic structure. Although unusual, once 7R allele is considered a risk allele by the literature, our findings are plausible. It is possible that different alleles confer risk or protection to ADHD in different populations. To comprehend DRD4 genetic structure and function and then investigate its association with ADHD, using phenotypes defined through different approaches (as endophenotypes, for example) and different methods of analyses might be more productive than strategies applied until now to elucidate the true contribution of DRD4 locus to this disease.