Análise de genes de Azospirillum amazonense envolvidos na resposta ao estresse oxidativo

Abstract

O surgimento e conseqüente acúmulo de O2 livre na atmosfera a partir do início da atividade fotossintética foi um evento que causou extinções em massa no nosso planeta. Apesar do grande aumento da quantidade de energia disponibilizado pela utilização do O2 na oxidação dos alimentos em comparação com a fermentação, a toxicidade do mesmo causou uma pressão seletiva nos organismos e o desenvolvimento de atividades de proteção contra o ataque do oxigênio e seus radicais aos clusters metálicos de enzimas de atividades essenciais como a nitrogenase e outras biomoléculas. Trabalhos demonstraram que o microrganismo diazotrófico Azospirillum amazonense, apesar de pouco estudado, está presente em grande quantidade no solo de pastagens e culturas de arroz, trigo, milho e cana-de-açúcar no Brasil, e além de estar adaptado à acidez do solo, produz importantes hormônios vegetais em associação com as mesmas. O presente estudo tem o objetivo de contribuir pa ra o entendimento da alta tolerância de A. amazonense ao estresse por oxigênio e seus radicais. A utilização do herbicida Gramoxone (Singenta) como indutor da resposta bacteriana resultou na resistência pelo microrganismo a concentrações maiores do que 100μM de paraquat. A metodologia de Representational Difference Analysis (cDNARDA) como forma de identificar genes diferencialmente expressos pela bactéria nessa condição resultou no isolamento de seis genes envolvidos direta e indiretamente no processo sendo um regulador transcricional da família GntR; uma alcanosulfonato monooxigenase; uma epimerase/desidratase dependente de NAD e uma serina protease. Este é o primeiro trabalho que utiliza emulsão fenólica em ciclos oscilatórios de temperatura (OSPERT) associada a cDNA-RDA. A metodologia utilizada mostrou ser funcional para as condições testadas sendo uma grande ferramenta para o estudo de expressão diferencial em organismos cujo genoma não é conhecido.

The emergence and consequent accumulation of free O2 in the atmosphere from the beginning of the photosynthetic activity was an event that caused mass extinctions on our planet. Despite of the large increase in the amount of energy available by the use of O2 in the oxidation of nutrients compared to the fermentation, the toxicity of the same caused a selective pressure on live organisms and the development of activities to protect against the attack of oxygen radicals in essential clusters of metallo-enzymes as nitrogenase and other biomolecules. Previous works showed that the diazotrophic microorganism Azospirillum amazonense, is present in large quantities in the soil, pasture, rice, wheat and sugarcane in Brazil, and besides being adapted to the acidity of the soil, is able to produce important phytormones in association with them. This study is intended to contribute to the understanding of the high tolerance of A. amazonense to stress by oxygen and their radicals. The use of the herbicide Gramoxone (Singenta) as inducer of bacterial response resulted in resistance greater then 100μM of paraquat by the microorganism. The methodology of Representational Difference Analysis (cDNA-RDA) as a way to identify genes expressed by bacteria in this specific conditions resulted in the isolation of six genes involved directly and indirectly in the process being a transcriptional regulator of the GntR family; an alcanosulfonato monooxigenase; a NAD dependent epimerase/desidratase and one serine protease. This is the first work that uses Oscillating Phenol Emulsion Reassociation Technique (OSPERT) in association with cDNA-RDA. The methodology used was shown to be functional for the conditions tested and it’s a powerful tool for the study of differential expression in organisms whose genome is unknown.