Purificação e caracterização de uma bacteriocina produzida por Bacillus sp. P45

Abstract

Uma bacteriocina produzida por um microrganismo isolado do intestino do peixe Jaraqui, da bacia Amazônica, foi caracterizada. A bactéria foi identificada como pertencente ao gênero Bacillus por testes citomorfológicos, bioquímicos e fisiológicos. A análise filogenética feita através da seqüência do rDNA 16S revelou que a bactéria é geneticamente próxima de bactérias como B. subtilis e B. amyloliquefaciens. A bacteriocina foi produzida no início da fase exponencial de crescimento e a sua concentração atingiu o nível máximo no início da fase estacionária, caracterizando-se como metabólito primário. O sobrenadante inibiu Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora entre outras espécies patogênicas. A atividade manteve-se constante em temperaturas de 10 a 100 ºC, por 30 minutos, iniciando um declínio a 100 ºC por 40 minutos. No teste do efeito de enzimas proteolíticas, a pronase E causou a perda do efeito antimicrobiano, indicando que se trata de uma substância de natureza protéica. A purificação foi realizada inicialmente por precipitação com sulfato de amônio, seguida de uma cromatografia de gel filtração (Sephadex G- 100). A etapa final foi a cromatografia de troca iônica (DEAE Sepharose). No final deste processo, obteve-se um fator de purificação de 42,6 com uma recuperação de 6,75%. A bacteriocina purificada manteve sua estabilidade térmica, mas perdeu a estabilidade frente a enzimas proteolíticas. O espectro de infravermelho indicou grupamentos NH e ligações peptídicas e o espectro de massas indicou um peptídeo de 1518,554 Da. A bacteriocina parcialmente purificada tem um EC50 de 400UA/mL e provocou uma diminuição de 6 logs de células de Listeria monocytogenes com 800UA/mL, provavelmente provocando lise celular.

A bacteriocin produced by a microrganism isolated from the intestine of the fish Jaraqui of the Amazonian basin was characterized. The bacterium was identified as a species of the Bacillus genus by cytomorphological, biochemical and physiological tests. The phylogenetical analysis done by 16S rDNA sequence revealed that the bacterium is genetically close to B. subtilis and B. amyloliquefaciens. The bacteriocin is produced at exponential growth phase and its concentration achieves the maximum level at stationary growth phase, suggesting that this compound is a primary metabolite. The culture supernatant was active against Staphylococcus aureus, Salmonella Gallinarium, Listeria monocytogenes, Erwinia caratorvora among other pathogenic species. The activity was constant in temperatures from 10 to 100 ºC for 30 minutes, begining to decline at 100 ºC for 40 minutos. When treated with proteolitic enzymes, pronase E caused the lost of the antimicrobian efect, proving that is a substance of proteinaceous nature. The purification was developed by ammoniun sulfate precipitation, followed by gel filtration chromatography (Sephadex G-100). The last step was an ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). By the end of this process, we have a purification factor of 42,6 and a yield of 6,75%. The purified bacteriocin keeps its thermal stability, but looses the stability towards proteolytic enzymes. The infrared spectrum indicates NH groups and peptidic bounds and the mass spectrum indicates a peptide of 1518,554 Da. The bacteriocin partially purified has a EC50 of 400UA/mL and kills all viable cells of Listeria monocytogenes with 800UA/mL, probably by cell lysis.