Avaliação da perda linfocitária do timo de frangos de corte utilizando sistema de análise digital de depleção linfóide (ADDL)

Abstract

O timo é um dos órgãos linfoides mais acometidos pelas patologias imunodepressoras, o qual geralmente é avaliado quanto ao grau de perda linfocitária a partir de técnicas histológicas subjetivas. Este trabalho teve como propósito a adaptação e aplicação do sistema ADDL (Análise Digital de Depleção Linfóide) em timos, a fim de tornar sua análise mais precisa. Primeiramente, realizou-se um estudo piloto, no qual foram utilizadas amostras de timo do trabalho desenvolvido por Camillotti (2011), porém constatou-se um número insatisfatório de lobos tímicos para os três escores de depleção linfocitária adotados, assim como dificuldade na categorização com apenas 3 graus de lesão. Optou-se, então, pela indução de imunodepressão através da utilização de um glicocorticóide, e pela classificação dos timos em cinco escores (1 a 5). Para tanto, foram utilizados 70 aves de um dia de idade, sendo que aos 21 dias de idade, foram separadas 15 aves para composição do grupo controle e 55 para o grupo tratado. Foi empregado o protocolo de tratamento com dexametasona adaptado de Kong, et al. (2002). Durante as coletas, de cada uma das aves, ambas as cadeias tímicas eram pesadas, sendo selecionados seis lobos para o processamento histológico de rotina, análise quanto ao grau de depleção linfocitária por dois avaliadores (A e B) e submissão a todas as etapas de processamento pelo sistema ADDL. Foram construídas ao final, cinco RNAs (Redes Neurais Artificiais): duas tendo em vista o escore por lobo (escore do avaliador A; escore do avaliador B) e três considerando o escore por ave (moda dos escores de 6 lobos/ave do avaliador A; moda dos escores de 6 lobos/ave do avaliador B, moda conjunta dos escores dos avaliadores A + B). A fim de relacionar o peso relativo (PR) do timo ao escore digital de depleção, foi aplicado o teste de correlação de Spearman, seguido de análise de regressão, e para evidenciar diferenças entre os escores atribuídos pelos avaliadores, utilizou o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney. Constatou-se que o tratamento com dexametasona permitiu a aquisição de timos com escores entre 1 a 5. Houve diferença significativa entre as leituras realizadas pelos avaliadores considerando o lobo e também entre a moda de escores dos dois avaliadores, assim como entre a moda do avaliador B e a moda conjunta (p<0,005). Foi observado que as duas RNAs construídas por lobo obtiveram um percentual de 50% de classificações corretas. As RNAs construídas utilizando a moda mostraram um percentual de acerto de 86,57% para o avaliador A, 80,60% para avaliador B e 94,03% para a rede construída a partir da moda conjunta dos avaliadores. Paralelamente, observou-se ρ= -0,77 e R2=0,58 entre as variáveis “PR” e “Escore digital de depleção linfocitária”. Em conclusão, foi possível a aplicação do sistema ADDL para timos, sendo a RNA treinada com a moda conjunta dos escores dos avaliadores A e B, o modelo que alcançou melhor desempenho. Portanto, o uso de ferramentas de análise de imagem em conjunto com as RNAs, torna possível uma avaliação do sistema imune da ave adotando critérios objetivos para as análises histológicas quanto a perda linfocitária.

The thymus is a lymphoid organs most affected by immunosuppressive diseases, which is usually assessed on the degree of lymphocyte loss from subjective histological techniques. This work aimed to the adaptation and application of the system DALD (Digital Analysis of Lymphoid Depletion) in the thymus in order to make your analysis more accurate. First,a pilot study was performed, in which samples from the thymus of the work of Camillotti (2011) were used, but it was found a number of poor thymic lobes for the three scores lymphocyte depletion adopted, as well as difficulty with categorization only three degrees of injury. It was decided, therefore, by inducing immunosuppression by using a glucocorticoid, and the classification of the five scores thymus (1 to 5). Therefore, 70 birds a day old were used, and at 21 days of age, 15 birds were separated for composition of the control group and 55 in the treated group. A treatment protocol with dexamethasone adapted Kong et al. (2002) was performed. During collection, each of the birds, both chains thymus were weighed, and selected six lobes for histological processing, analysis of the degree of lymphocyte depletion by two raters (A and B) and submission to all stages of DALD processing by the system. At the end of five ANNs (Artificial Neural Networks) were built: two in view of the score by lobe (The score evaluator, the evaluator score B) and three taking the score per bird (mode scores of 6 lobes / bird evaluator The; mode scores of 6 lobes / bird evaluator B, trendy joint scores of evaluators A + B). In order to relate the relative weight (RW) of the thymus to score digital depletion the Spearman correlation test was used, followed by regression analysis, and to highlight differences between the scores assigned by the evaluators used the Wilcoxon- Mann- Whitney test. It was found that treatment with dexamethasone permitted the acquisition of thymus with scores ranging from 1 to 5. Significant difference between the readings made by the evaluators considering the lobe and also between mode scores of two raters, as well as between mode evaluator B and joint mode (p <0.005). It was observed that the two ANNs constructed by lobe obtained a percentage of 50% correct classifications. ANNs built using the fashion shown a percentage of accuracy of 86.57% for the evaluator A, 80.60% to avaliator B and 94,03% for the network constructed from the trendy joint assessors. In parallel, it was noted ρ = -0.77, and R2 = 0.58 between "RW" and "digital lymphoid depletion score". In conclusion, it was possible to apply the system to DALD sweetbreads, and the trained ANN with mode combined scores of raters A and B, the model achieved better performance. Therefore, the use of image analysis tools along with the ANNs makes possible an assessment of the bird's immune system adopting objective criteria for histological analyzes as the lymphocyte loss.