Investigação do efeito neuroprotetor do coumestrol em modelos in vitro e in vivo na isquemia cerebral experimental

Abstract

Pacientes que sobrevivem a uma parada cardíaca ou a um AVE demonstram uma alta incidência de prejuízos neurológicos como resultado do dano neuronal isquêmico tardio. Uma intervenção farmacológica apropriada durante a janela terapêutica entre o recomeço do fluxo sanguíneo normal e o início do dano neuronal seria de grande benefício, porém as abordagens experimentais atuais são limitadas neste sentido. Ao longo da última década, dados provenientes de muitos estudos apoiam a ideia que estrógenos promovem efeitos neuroprotetores em uma variedade de doenças neurodegenerativas, incluindo a isquemia cerebral global. O potente hormônio feminino 17-β-estradiol (E2) é neuroprotetor em uma variedade de modelos celulares e animais de isquemia, contudo os paraefeitos inerentes a sua terapêutica não permitem seu uso em larga escala. Considerando a estrutura e mecanismo de ação similares dos fitoestrogênios no SNC, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos neuroprotetores de coumestrol, um potente isoflavonóide com alta afinidade de ligação por ambos os receptores de estrogênio (ERs) e alto potencial antioxidante, contra a neurodegeneração geralmente encontrada em eventos isquêmicos. Nós demonstramos aqui que coumestrol foi hábil em resgatar a morte neuronal na subárea CA1 hipocampal induzida pela isquemia global em ratas fêmeas em uma avaliação de sobrevivência celular, incluindo 24h pós-isquemia, e que esta neuroproteção parece ser mediada através dos ERs. Em um próximo passo, avaliamos se a pré-administração de coumestrol poderia reverter a atividade da bomba de Na+/K+-ATPase, cuja atividade se encontra prejudicada após insultos isquêmicos, e se sua ação seria igualmente efetiva quando administrado em ratos machos. A análise demonstrou que coumestrol foi eficiente em restaurar a atividade da Na+/K+-ATPase em todos os tempos avaliados, incluindo 24h pós-isquemia. A efetividade em prevenir a morte neuronal em ratos machos foi igualmente observada em todos os tempos de administração, incluindo 24h pós-isquemia. As correspondências neuroprotetoras no tempo de 24h na neuroproteção sugerem um possível mecanismo pelo qual coumestrol possa estar agindo para promover neuroproteção em longo prazo. Sabendo que a morte neuronal tardia na isquemia global está associada com a redução na expressão de GluR2 na região CA1 pouco antes do início da morte celular, examinamos o possível papel de coumestrol na expressão de GluR2 em camundongos machos em três diferentes tempos pós-isquemia. O evento isquêmico reduziu os níveis proteicos de GluR2 hipocampais em todos os tempos avaliados e o tratamento com coumestrol foi efetivo em prevenir essa redução. Adicionalmente, estando consciente que a excitotoxicidade é um dos mecanismos celulares ligados à neurodegeneração associada à isquemia, buscou-se determinar se coumestrol poderia promover neuroproteção in vitro, contra a excitotoxicidade induzida por NMDA em culturas neuronais hipocampais. Nós observamos que coumestrol promoveu neuroproteção, porém somente quando sua administração foi perto do evento excitotóxico. Atribuímos esta inabilidade em conferir neuroproteção em longo prazo devido à presença do inibidor de células gliais presente na cultura neuronal, que limita a proliferação glial em 10% ou menos, sugerindo o sistema glial como um importante coadjuvante no contexto da neuroproteção em longo prazo conferida por coumestrol. Estendendo nossa investigação para uma avaliação comportamental, examinamos se coumestrol poderia ser igualmente eficaz em prevenir os déficits de memória presentes após um insulto isquêmico. A análise histológica confirmou a neuroproteção promovida pela administração de coumestrol como esperado, e sua terapêutica foi bem sucedida em reverter os déficits de memória promovidos pela isquemia global. Portanto, esses resultados coletivos indicam que coumestrol desperta novas perspectivas dentro da terapêutica da isquemia global e abre novas possibilidades na investigação no contexto dos acidentes vasculares encefálicos.

Patients who survive cardiac arrest or stroke demonstrate a high incidence of neurological impairment as a result of delayed ischemic neuronal damage. Proper pharmacological intervention during the therapeutic window between the resumption of normal blood flow and the onset of neuronal damage would be of great benefit, but the current experimental approaches have yielded only limited success. Over the last decade, data from many studies support the idea that estrogens provide neuroprotective effects in a variety of neurodegenerative diseases, including cerebral global ischemia. The potent feminizing hormone 17-β-estradiol (E2) is neuroprotective in a host of cell and animal models of stroke, however the side effects inherent its therapeutics doesn’t allow its use in a large scale. Considering the similar structure of phytoestrogens and its similar actions within the CNS, the aim of this study was verify the neuroprotective effects of coumestrol, a potent isoflavonoid with high binding affinities for both estrogen receptors (ERs) and significant antioxidant activity, against neurodegeneration usually observed in global ischemic events. We demonstrate here that coumestrol was able to rescue neuronal death in the hippocampal CA1 subfield induced by global ischemia in female rats in a cell survival evaluation, including 24h after ischemia, and its neuroprotective actions seems to be through the ERs. In a next step, we evaluated if coumestrol pre-administration could rescue the Na+/K+-ATPase activity that is found severely impaired after ischemic insults, and if its administration would be equally neuroprotective in male rats. The analysis showed that coumestrol was able to reverse the Na+/K+-ATPase activity in all times of evaluation, including 24h after ischemia. The effectiveness in preventing neuronal death in male rats was also observed in all time-points evaluated, including 24h after ischemia. These two 24h correspondence in neuroprotection suggests one possible mechanism by which coumestrol could be acting to afford neuroprotection in a long term. Knowing that the delayed neuronal death in global ischemia is associated with a reduced GluR2 expression in CA1 hippocampal field just before the cell death onset, we examined the possible role of coumestrol at the level of GluR2 expression of male mice in three different time-points after ischemia. The ischemic event induced high suppression of GluR2 in all evaluated times and coumestrol pre-treatment was able in preventing this reduction. In addition, being aware that excitotoxicity is one of the cellular mechanisms linked to cerebral ischemic neurodegeneration, we sought to determine if coumestrol could be neuroprotective in vitro as well, against a NMDA-induced excitotoxicity in hippocampal neuronal culture. We observed that coumestrol was skilled to afford neuroprotection only when its administration was next to the excitotoxic event. We attribute this longest reach inability of neuroprotection due the glial inhibitor present in the neuronal culture, which limits the glial cells proliferation in 10% or less, suggesting the glial system as an important adjuvant in the context of the coumestrol longer therapeutic window. Extending our investigation in a behavior assessment, we examined if the coumestrol could be also virtuous in preventing the memory deficits present after an ischemic insult. The histological analysis confirmed the reduction in neuronal loss afforded by coumestrol administration as expected, and its pre ischemic administration was able to rescue the memory impairment promoted by the global ischemia. Therefore, our collective results indicate that coumestrol spread new perspectives in the context of global ischemia therapeutics and unlock new possibilities for the stroke investigation.