Estratégias farmacológicas para a redução da população de células tronco tumorais em glioblastoma

Abstract

Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM.

Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.