Utilização do corante azul cresil brilhante como método de seleção de oócitos humanos destinados à maturação in vitro

Abstract

A maturação in vitro (MIV) de oócitos é uma técnica de Reprodução Assistida (RA) que apresenta inúmeras vantagens e aplicabilidades. No entanto, a qualidade dos gametas imaturos que são destinados a ela é bastante divergente, tornando-se necessário o desenvolvimento de técnicas que auxiliem na seleção dos gametas competentes, ou seja, aptos à MIV. A partir do conhecimento de que oócitos em fase de crescimento apresentam alta atividade específica da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), e que oócitos que finalizaram seu crescimento apresentam baixa atividade específica dessa enzima, foi proposta a coloração dos gametas com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB) como método de seleção dos oócitos competentes. Esse corante é capaz de ser metabolizado pela G6PDH, resultando na coloração dos gametas capacitados (classificados como BCB positivo), mas não dos gametas que ainda estão em fase de crescimento, que permanecem incolores e são classificados como BCB negativo. Em animais, foi demonstrado que essa técnica permite selecionar melhor os gametas e, consequentemente, aumentar não só as taxas de maturação oocitária nuclear e citoplasmática, como também as taxas de fertilização, de formação de blastocisto e de nascidos vivos. No entanto, apenas modelos animais foram utilizados até o presente momento. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência e a segurança da exposição de gametas humanos ao BCB como método de seleção de gametas competentes antes da MIV. Para isso, três diferentes perfis de pacientes tiveram seus oócitos imaturos incluídos no estudo: 6 pacientes cuja ovulação foi induzida e gametas imaturos foram captados (17 oócitos); 3 pacientes ooforectomizadas (20 oócitos recuperados); e 32 gestantes cujos oócitos foram captados durante a cesareana (92 oócitos recuperados). Os oócitos imaturos foram divididos em dois grupos: controle (colocado imediatamente para MIV) e tratado – exposto a 26 μM de BCB por 60 minutos. Após coloração, de acordo com a coloração do citoplasma, o grupo tratado foi classificado em BCB positivo ou negativo e destinado à MIV. Após 24 e 48 horas de MIV, foi avaliado o grau de maturação nuclear. A taxa de MIV dos oócitos recuperados de pacientes estimuladas e ooforectomizadas foi igual entre os grupos após 24 e 48 horas. No entanto, a taxa de MIV foi significativamente superior no grupo BCB positivo quando comparado com o grupo BCB negativo, tanto para os oócitos de todas as pacientes (P = 0,024 e P = 0,015) como quando os oócitos das gestantes (P = 0,004 e P = 0,032) foram avaliados separadamente, após 24 e 48 horas de MIV, respectivamente. O grupo controle foi similar ao grupo BCB positivo. A taxa de retomada de meiose (ausência de vesícula germinativa) após 24 horas foi igual entre os grupos, independente da fonte de recuperação dos gametas. Contudo, ao avaliar todos os gametas após 48 horas de MIV, a taxa de retomada de meiose foi superior no grupo BCB positivo, quando comparado com os demais grupos (P = 0,035). Quando os oócitos foram avaliados em conjunto, o grupo BCB positivo apresentou as menores taxas de degeneração (P = 0,002). Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o BCB pode ser um bom marcador na seleção de oócitos humanos competentes e não é tóxico para o gameta humano.

The in vitro maturation (IVM) is an Assisted Reproduction Technique (ART) that presents many advantages. However, the quality of immature oocytes destined to IVM is very divergent. That’s why pre-selection procedures of developmentally competent oocytes are important. Growing oocytes synthesize glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), but this enzyme is inactivated in oocytes that have completed their growth phase. Once Brilliant Cresyl Blue (BCB) can be reduced by G6PDH, it is suggested that BCB staining can select fully grown oocytes, when exposed to BCB – the cytoplasm of these eggs will appear blue, being classified as BCB positive, whereas oocytes still in growth phase will not be stained (cytoplasm will appear colourless, being classified as BCB negative). It has been already demonstrated that this selection can improve not only nuclear and cytoplasmic oocyte maturation, but also fertilization and blastocyst rates. However, only animal models were utilized until the present. Consequently, the aim of the experiment was to evaluate the efficiency and safety of BCB staining as a selection of developmentally competent immature human oocytes before IVM. Three kinds of patients were included in the study: 6 hormonal stimulated patients with immature oocytes at retrieval (17 oocytes); 3 ooforectomized patients (20 oocytes recovered); and 32 pregnant patients during cesarean section (92 oocytes recovered). Immature oocytes were divided into groups: control (disposed directly to IVM) and treated - exposed to BCB 26μM during 60 minutes. After staining, treated group was classified as cytoplasm coloration, BCB positive or negative, and then disposed to IVM. After 24 and 48 hours of IVM, nuclear status was checked. The IVM rate of immature oocytes recovered from stimulated and ooforectomized patients was equal among groups either after 24 or 48 hours of IVM. Nevertheless, IVM was higher in BCB positive compared to BCB negative after 24 and 48 hours of IVM analyzing oocytes recovered from all patients (P = 0.024 and P = 0.015), and from cesarean patients (P = 0.004 and P = 0.032). The control group was equal to BCB positive. The meiosis resumption rate (absence of germinal vesicle) after 24 hours of IVM was equal among groups, but higher in BCB positive compared to other groups after 48 hours when all gametes were analyzed jointly (P = 0.035). Degeneration rate was lower in BCB positive compared to their counterparts when oocytes were analyzed jointly (P = 0.002). In conclusion, BCB test can be a good marker in pre-selection procedures of developmentally competent human oocytes and, apparently, it is not toxic to the gamete.