Tipagem molecular de leveduras associadas a vinhos do sul do Brasil : padronização de MSP-PCR Fingerprinting

Abstract

A identificação das leveduras participantes no processo fermentativo de vinhos comerciais e artesanais permite inferir as propriedades organolépticas, concentração de álcool e qualidade do produto final. Assim, a construção de uma base de dados que permita discriminar e identificar leveduras associadas a vinhos é necessário para monitorar o processo fermentativo e controlar os seus contaminantes. A principal proposta deste trabalho foi avaliar a técnica MSP-PCR Fingerprinting usando o oligonucleotídeo iniciador (GTG)5 para discriminar espécies de leveduras associadas a vinho no sul do Brasil. O protocolo foi otimizado usando três cepas variando as concentrações de dNTPs, MgCl2, oligonucleotídeo iniciador e DNA. Foram analisadas 113 cepas de leveduras associadas a vinhos dos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Brasil). A análise de clustering do tamanho e distribuição das bandas, baseada no algoritmo QAPgrid, usando distâncias euclidianas, gerou 20 agrupamentos com 22 perfis genéticos. A comparação das sequências da região D1/D2 do gene 26S rDNA e/ou região ITS com a base de dados Genbank usando o algoritmo Mega Blast permitiu identificar 10 espécies dos gêneros Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, entre outros, associadas a vinhos. Assim, o algoritmo QAPgrid foi capaz de analisar a variabilidade inter e intraespecífica dos 113 isolados de forma não aleatória e dependente da similaridade genética. Se propõe o agrupamento molecular usando o primer (GTG)5 associado ao sequenciamento de 10% dos isolados dentro de cada grupo como ferramenta para identificar e monitorar as populações de leveduras de vinhos.

The identification of yeasts involved in commercial and artisanal alcoholic fermentation allows inferences concerning the organoleptic properties and quality of the final product. Thus, the construction of a database that allows discriminating and identifying the wine yeasts is necessary to monitor the fermentation process and control their contaminants. The main purpose of this study was to evaluate the MSP-PCR fingerprinting technique using the primer (GTG)5 for discrimination of wine yeast species in Southern Brazil. The protocol was optimized using three strains varying concentrations of dNTPs mix, MgCl2, primer and DNA. We analyzed 113 strains of yeasts associated with wine from the states of Santa Catarina and Rio Grande do Sul (Brazil). The analysis of cluster size and distribution of bands, based on the QAPgrid algorithm using Euclidean distances generated 20 clusters with 22 genetic profiles. The comparison of sequences of the D1/D2 domain of the gene 26S rDNA and/or ITS region with the GenBank database using the Blast algorithm identified 10 species of the genera Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, and others associated with the wine. The algorithm QAPgrid was able to analyze inter and intra-specific variability of 113 isolates in a non-random manner dependent on genetic similarity. We propose the molecular clustering using the primer (GTG)5 followed by sequencing of 10% of the isolates within each group can function as a tool for identifying and monitoring the wine yeast populations.