Desenvolvimento de protocolo para criopreservação de folículos ovarianos de peixes usando vitrificação

Abstract

A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro.

Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.