Cultura de anteras e embriogênese de genótipos selecionados de cevada (Hordeum vulgare L.ssp.vulgare)

Abstract

A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas, por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens selecionadas da cultivar A-05 (S₃A22 e S₃A23), e da cultivar BR-2(S₃B63 e, apenas na cultura de anteras, S₃B61), bem como da cultivar MN-599 (não-selecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias, duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram secionados longitudinalmente com 3 mm de espessura. Para as análises citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN- 599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos xiii embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a linhagem S₃A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S₃B63 não apresentou embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2º dia de cultivo in vitro) até o final (34º dia), foram observados micrósporos, o mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro, em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3º dia, enquanto que os multicelulares a partir do 4º dia de cultivo. As estruturas multicelulares foram observadas a partir do 8º dia. A quantidade e o tamanho das estruturas multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do 14º ao 20º dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22º dia (cultivar MN- 599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras. Para as linhagens, a partir do 18º dia foram observadas estruturas multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2. MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo observados mais cedo na linhagem S₃A22 e S₃A23, do que na cultivar MN-599.

The efficiency of anther culture technique, on a commercial scale, can be considered low when the number of fertile double-haploid plants obtained from single anthers established in vitro is evaluated. The present work pioneers a detailed study of in vitro microspores and young pollen embryogenesis of barley (Hordeum vulgare L ssp. vugare). Aiming for the improvement of anther culture technique, cytological and histological analyses of barley in vitro embryogenesis were made, with special emphasis on the induction stage. A Brazilian cultivar of barley (MN-599) was compared with strains of two other cultivars, previously selected, for three generations, for divergent responses to the induction process of in vitro culture, as well as to green plant regeneration, i.e. better response to induction and worse to green plant regeneration (strains S₃A22 and S₃A23 selected from cultivar A-05) or worse response to induction and better to green plant regeneration (S₃B63 and S₃B61 – the last one only analyzed for anther culture; both obtained from cv. BR-2). Only anthers with microspores and young pollen grains were cultured in vitro. For the histological analyses, two anthers from each row of the same spike were fixed, every two days after the beginning of in vitro culture. Anthers and respective multicellular structures were fixed in 50% FAA, dehydrated in ethylic series and included in hydroxyethylmetacrylate. The blocks of polymerized resin were longitudinally cut into 3mm thick sections. For the cytological analyses, three spikelets were fixed, one from the base, other from the middle and another from the top of each just collected spike. After the low temperature (5 oC) pretreatment, but before in vitro culture, three anthers (from the opposite row of each spike) were fixed. These two samples were used as controls. Every three days after the beginning of in vitro culture, three anthers were fixed – until the 18th day. Anthers and multicellular structures from in vitro culture were fixed in Farmer or 50% FAA and transferred to 70% ethanol after 24 hours. Differences were observed between in vitro cultivated anthers of one strain of cv A-05 and cultivar MN-599, in their initial production of embryogenic structures, but the total, final production did not differ. But differences were observed between cultivar MN- 599 and strain S₃A22 in embryo formation: cv. MN-599 produced well differentiated embryos, but embryos of strain S₃A22, besides in smaller number, were less differentiated. No embryo was found in all histologically analyzed samples of strain S3B63. However, considering that another sample of this same strain also cultivated in vitro generated green plants, one can propose that embryos formation does occur but later than in cv. MN-599, after 34 days in culture. One should emphasize that significant differences were found between the cultivars A-05 and BR-2 as for green plant generation. These results indicate that selection was more efficient for the plant regeneration step than for the induction phase. As for the results of in vitro culture of microspores and pollen grains, it was observed that, from the first sample of histological analyses (2nd day of in vitro culture) until the last one (34th day in culture), microspores were always present; the same was observed for the cytological analyses. Multinucleated pollen grains were observed at almost all analyzed samples; but they did not occur in the two controls of cytological analyses – i.e. before in vitro culture. Multinucleated grains were observed, in culture, from the 3rd day on. Multicellular were present in vitro culture from the 4th day on. Multicellular structures were first observed at 8th day. Multicellular structures varied in number and size at different samples of histological analysis, reaching the largest size from the 14th to the 20th day, as a result of cell proliferation due to successive mitoses. From the 22nd day on, in cultivar MN-599, there was a decrease in number of multicellular structures inside the anther loculi, but an increase and predominance of proliferation outside the anthers. As for the strains, from the 18th day on, multicellular structures liberated from the anthers were observed. The analyses of multicellular structures allowed to classify them in four classes: 1. SFD = without a defined shape; 2. MAC = shoot apical meristem; 3. MAR = adventitious embryonary apical root meristem; and 4. Embryos. The largest class was that of amorphous structures, when compared with the remaining classes. Summarizing, it was shown that the selected strains and the non-selected cultivar differed, not only in time needed for embryos formation, but also in the degree of embryo differentiation; embryos of cultivar MN-599 were well-differentiated, what was not observed for strain S₃A22 and S₃A23; however these strains produced embryos earlier than the cultivar.