Investigação de proteínas envolvidas na vulnerabilidade seletiva do hipocampo

Abstract

Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões.

One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.