Identificação e análise de expressão de microRNAs em tecidos florais de soja (Glycine max (L.) Merrill)

Abstract

A soja é uma das culturas mais importantes a nível mundial, devido à produção de óleo e a seu alto teor proteico. A fase reprodutiva é a mais importante para a produtividade da soja, visto que seu cultivo se destina principalmente à produção de grãos. Os microRNAs (miRNAs) desempenham funções essenciais em diversos aspectos do desenvolvimento reprodutivo, incluindo o florescimento, a fertilidade e o desenvolvimento da semente. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através de clivagem e inibição da tradução de mRNAs alvos. A identificação de miRNAs ainda não está saturada e, em soja, não há trabalhos relacionando-os aos diferentes órgãos florais, que são fundamentais na produtividade desta cultura. Neste estudo, amostras de flores, carpelos, estames e pétalas de soja foram usadas na construção de quatro bibliotecas de sRNAs sequenciadas utilizando a plataforma Solexa, gerando um total de 13.557.795 sequências. Através da análise do mapeamento das sequências de sRNAs das bibliotecas em candidatos a precursores de miRNAs de soja identificados, 276 foram considerados precursores autênticos, incluindo 143 precursores novos. Foram identificados 235 miRNAs maduros, dos quais 51 são miRNAs inéditos, pertencentes a 40 novas famílias. Os demais miRNAs identificados pertencem a 64 famílias conhecidas de miRNAs de plantas, das quais três ainda não tinham sido reportadas em soja. Todas as famílias de miRNAs que estão envolvidas na regulação do florescimento foram identificadas entre as mais frequentes nos tecidos florais de soja. Na análise de expressão pela frequência de sequências nas bibliotecas de sRNAs de carpelos, estames e pétalas, 67.2% (158) dos miRNAs identificados foram diferencialmente expressos. Análises de expressão por PCR quantitativa (RT-qPCR) comprovaram a expressão diferencial de 19 miRNAs. O miRNA inédito denominado NF13 apresentou a maior diferença entre os tecidos, sendo fortemente induzido nos carpelos. Para os miRNAs com expressão diferencial comprovada por RT-qPCR foi feita a predição computacional dos genes alvos, para muitos dos quais já foram descritas funções relacionadas ao processo reprodutivo em plantas. O estudo da regulação destes genes pelos miRNAs em diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento floral contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na reprodução da soja.

Soybean is one of the most important crops worldwide, due to the production of oil and its high protein content. The reproductive phase is considered the most important for the yield of soybean, which is mainly intended to produce the grains. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of reproductive development, including flowering, fertility and seed development. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target mRNAs. The identification of miRNAs is not yet saturated in soybeans, and there are no studies linking them to the different floral organs, which are fundamental in the productivity of this crop. In this study, samples of flowers, carpels, petals and stamens of soybeans were used in the construction of four sRNA libraries sequenced using the platform Solexa, generating a total of 13,557,795 sequences. The sRNAs sequences from four libraries were mapped in precursors candidates. Among them, 276 were considered authentic precursors, including 143 new precursors. 235 mature miRNAs were identified, of which 51 are novel miRNAs belonging to 40 new families. The other identified miRNAs belongs to 64 known plant miRNA families, of which three had not yet been reported in soybean. All miRNAs families which are involved in regulating flowering were identified among the most frequent floral tissue of soybean. Expression analysis based on the frequency of sequences in the libraries of sRNAs of carpels, stamens and petals demonstrated that 67.2% (158) corresponded to differentially expressed miRNAs. Most of 22 and 24 nt miRNAs that were differentially expressed was induced in carpels, suggesting that these miRNAs sizes are important in regulating the processes occurring specifically in these organs. Analysis of expression by quantitative PCR (RT-qPCR) confirmed the differential expression of 19 miRNAs. The novel miRNA named NF13 showed the greatest difference between the tissues and is strongly induced in the carpels. A computational prediction of targets for miRNAs with differential expression confirmed by RT-qPCR was performed. Many of the predicted targets have described functions related to the reproductive process in plants. The study of regulation of these genes by miRNAs in different tissues and stages of flower development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in reproduction of soybean.