Análise comparativa entre diferentes sistemas de criopreservação de tecido ovariano de ratas wistar

Abstract

O objetivo deste trabalho foi determinar o protocolo mais eficiente de criopreservação de tecido ovariano utilizando o sistema automático de congelação, que requer rampas de resfriamento gradativo, modelo Freeze Control®, para comparar a integridade do tecido ovariano congelado através de duas diferentes curvas de congelação combinadas com dois diferentes crioprotetores: dimetilsulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG). Para a realização do trabalho foram utilizadas 20 ratas Wistar que foram submetidas à oofarectomia bilateral. Os ovários foram divididos em duas partes, uma parte foi criopreservada em DMSO 1,5M e a outra em EG 1,5M. Ainda, foram analisadas duas curvas de congelamento (curva lenta com duração de 1h e 50min, e uma curva rápida com duração de 35 min). As amostras de tecido, após congelação, foram descongeladas, fixadas e processadas para a coloração com hematoxilina e eosina para a análise da integridade dos oócitos. Finalmente fez-se a análise e quantificação dos folículos íntegros versus os não íntegros, como também o dano tecidual. Para a análise folicular foi utilizado o microscópio óptico em aumento de 400x e realizou-se a classificação dos folículos pré-antrais de acordo com o estágio de desenvolvimento em primordiais e primários. Os resultados foram submetidos à ANOVA e as comparações entre as médias feitas pelo teste de Tukey com (P<0,05). Nos resultados foi observado que no tecido criopreservado os folículos que persistiram íntegros em cada ovário foram os primordiais em 79% e primários em 29%. Já no tecido não congelado (controle) foram encontrados todos os tipos foliculares, primordiais, primários, secundários, pré-antrais e antrais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se vacuolizacão citoplasmática e contorno irregular. Quanto às alterações irreversíveis foi encontrado picnose. Concluindo, no tecido ovariano criopreservado, foram encontrados apenas folículos primordiais e primários apresentando alterações histológicas reversíveis e irreversíveis. Além disso, o crioprotetor EG promoveu uma melhor preservação destes folículos, comparado com o DMSO. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa, na preservação dos folículos, quando se comparou as duas curvas de congelação.

The aim of this study was to determine the most efficient protocol of cryopreservation of ovarian tissue using authomatic freezing system. This system requires Freeze Control® ramps of gradative cooling to compare the integrity of frozen ovarian tissue through two different freezing curves together with two different cryoprotectants: dimethilsulphoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG). In this work 20 Wistar female rats were submitted to bilateral oophorectomy. The ovaries were divided in two parts, one part was cryopreserved in DMSO 1,5M and the other in EG 1,5M. Two frozen curves (a slow curve lasting 1h and 50min and a rapid curve lasting 35min) were analyzed. The tissue samples were frozen and after defrosted, fixed, and processed to hematoxylin and eosin staining to analyse oocyte. The analysis and quantification of integrated follicles, non-integrated, and tissue damage was performed. In the follicular analysis it was used 400x optical microscope and performed the classification of pre-antral follicles in primordial and primary according to their stage of development. The results were submitted to ANOVA and the comparasions between the averages were done using the Tukey test (P<0,05). It was observed that in the cryopreserved tissue the follicles remaining integrated in each ovary were 79% primordial and 29% primary. In the non-frozen tissue (control) were found all kinds follicular primordial, primary, secondary, preantral and antral follicles. Cytoplasmic vacuolization and irregular cell outline were identified among reversible alterations. Picnosis was found as an irreversible alteration. To conclude only primordial and primary follicles were enconutered in the ovarian tissue cryopreserved and there are revisable and irreversible histological alterations. Furthermore, the crioprotectant EG was more efficient then DMSO in other to preserve a higher number of primordial and primary viable folicules. No statistical significant difference was detected when we compare the two curves of cryopreservation system.