A exposição conjunta a microplásticos de poliestireno potencializa a toxicidade intestinal, periférica e cerebral induzida por doses subtóxicas de metilmercúrio in vivo

Abstract

As contribuições antrópicas para diversos tipos de contaminações ambientais atingem níveis cada vez mais alarmantes. O mercúrio é um elemento natural da crosta terrestre cujas emissões ainda são majoritariamente antrópicas. No contexto brasileiro e latino-americano, a emissão do mercúrio está intrinsicamente relacionada com a mineração ilegal do ouro na Floresta Amazônica. Esta atividade leva à um despejo não-regulado do mercúrio nos corpos d’água da região e acaba afetando espécies de fauna e flora, populações urbanas e ribeirinhas, e também povos indígenas tradicionais. Também entre estas contaminações antrópicas, a presença de micro e nanoplásticos hoje é considerada onipresente, atingindo os mais diferentes organismos e recebendo mais atenção a cada dia. Apesar dos mecanismos de toxicidade de matrizes plásticas poliméricas serem cada vez mais elucidados, os esforços quanto a compreensão da toxicologia das misturas entre micro/nanoplásticos e outros contaminantes ambientais ainda são escassos. Este trabalho investigou a toxicidade conjunta entre uma espécie mercurial orgânica ambientalmente relevante e extremamente tóxica – o metilmercúrio – e esferas pristinas de microplásticos primários feitos de poliestireno e com 5μm de diâmetro. Para isso, ratos Wistar com 30 dias de vida foram utilizados para ser observar os efeitos in vivo da exposição a 0,5 mg/L de metilmercúrio + 0,2 mg/L de microplásticos de poliestireno através da água durante 8 semanas, refletindo uma exposição subtóxica e crônica, similar às exposições latentes em populações humanas da bacia Amazônica. Foi avaliado se a exposição, individual e conjunta, é capaz de desencadear sintomas típicos de doenças inflamatórias intestinais nos animais e, se os microplásticos de poliestireno são capazes de amplificar a neurotoxicidade desencadeada pela exposição ao metilmercúrio. A estrutura, arquitetura, e a produção de muco do cólon foi avaliada por microscopia; marcadores de inflamação e estresse oxidativo foram avaliados por espectrofotometria; a microbiota foi determinada por amplificação da região 16S do material extraído do bolo cecal e sequenciamento por Ion Torrent. No sistema nervoso central a permeabilidade da barreira hematoencefálica foi avaliada pelo extravasamento do corante Azul de Evans e por imunoblot de proteínas de junção-oclusiva, metaloproteinases, do receptor RAGE e da via de sinalização da mTOR; e a neuroinflamação foi avaliada por marcação fluorescente de IBA-1 e RT-qPCR. Ensaios comportamentais do tipo campo aberto e labirinto de cruz elevada foram realizados para avaliar tigmotaxia e o comportamento tipo-ansioso ou tipo-depressivo. Apesar das exposições individuais desencadearem algumas alterações moleculares, estas não refletiram em alterações comportamentais claras. Por outro lado, a exposição conjunta desencadeou uma série de alterações moleculares não observadas durante a exposição individual, e que refletiram em alterações significativas no comportamento animal. Em conclusão, os contaminantes agem através de mecanismos moleculares convergentes e distintos. Afetando órgãos periféricos não associados ao sistema nervoso que, ao serem transmitidos por vias aferentes distintas desencadearam um efeito mais severo no cérebro.

The human contributions to several environmental contaminations reach levels ever so more alarming. Mercury is a natural element of the earths crust whose emissions still are majorly anthropic. In the Brazilian and Latin-American context, mercury emission is intrinsically related to illegal gold mining in the Amazon Rainforest. This activity leads to the non-regulated disposal of mercury in the water bodies of the region and affects species of fauna and flora, urban and riverside populations, but also traditional indigenous people. Also, among anthropic contaminants, the presence of micro and nanoplastics is considered omnipresent today, reaching the most diverse organisms and receiving more attention each day. Even though the toxicity mechanisms of polymeric plastic matrices are ever so more elucidated, the efforts regarding the comprehension of mixture toxicology between micro/nanoplastics and other environmental contaminants are still scarce. This work investigated the combined toxicity between an environmentally relevant and extremely toxic organic mercurial species – methylmercury – and pristine primary microplastic spheres made from polystyrene and with 5μm diameter. For this, 30 days old Wistar rats were used to observe the in vivo effects of exposure to 0,5 mg/L methylmercury + 0,2 mg/L of polystyrene microplastics through drinking-water during 8 weeks. Reflecting a subtoxic and chronic exposure similar to the latent exposures of the human populations in the Amazonic basin. It was evaluated whether the individual or combined exposures are able to trigger symptoms typical of inflammatory bowel diseases in the animals, and if polystyrene microplastics are capable of amplifying the neurotoxicity triggered by methylmercury exposure. Colon structure, architecture and mucus production was evaluated by microscopy; inflammatory and oxidative stress markers were evaluated by spectrophotometry; microbiome was determined by amplification of the 16S region of the material extracted from the cecum matter and sequenced by Ion Torrent. In the central nervous system the permeability of the blood-brain barrier was evaluated by the extravasation of Evans Blue dye and through immunoblot of tight-junction proteins, metaloproteinases, the RAGE receptor and mTOR signaling; neuroinflammation was evaluated by fluorescent IBA-1 staining and RT-qPCR. Open field and elevated plus maze behavioral tests were performed to evaluate thigmotaxic behavior and anxiety-like or depressive-like behavior. Even though individual exposures triggered some molecular alterations, these didn’t reflect in clear behavioral changes. On the other hand, the combined exposure triggered a series of molecular alterations not observed during individual exposure, reflecting in significant alterations to animal behavior. In conclusion, the contaminants act through converging and distinct molecular mechanism. Affecting peripheral organs not associated to the central nervous system, that when transferred through afferent pathways trigger a more severe effect on the brain. This thesis paves the way for future works involving the toxicology and biochemistry of these contaminants’ mixture and emphasizes the need to considered combined contaminations in risk assessment of affected areas and populations.