Caracterização do impacto da inibição farmacológica da DNA polimerase eta (Pol η) na via IRE1-XBP1 em modelo celular de glioblastoma

Abstract

O glioblastoma multiforme (GBM) é um tumor agressivo caracterizado por alta resistência a terapias genotóxicas, frequentemente evadindo danos no DNA através de vias de reparo e tolerância. Dentre elas, a via de síntese translesão (TLS), mediada pelas polimerases da família Y, possui papel fundamental na replicação de material genético mesmo na presença de lesões. Evidências sugerem uma intersecção entre instabilidade genômica e estresse proteotóxico através da Resposta a Proteínas Mal Enoveladas (UPR). O presente estudo buscou investigar o impacto da inibição farmacológica de POLH na regulação do eixo IRE1/XBP1 da UPR em um modelo de glioblastoma. Células A172 expressando constitutivamente os repórteres fluorescentes XBP1-mNeonGreen e Apple-53BP1trunc foram expostas a tratamentos com PNR-7-02, Olaparib, Tapsigargina e Temozolomida. A ativação do repórter foi monitorada por microscopia de time-lapse e end-point. As expressões gênica e proteica foram quantificadas por RT-PCR e Western Blot, respectivamente. Como resultado, a inibição de POLH gerou um acúmulo massivo e rápido da forma processada do repórter de XBP1, superando o induzido pelo controle positivo Tapsigargina. A hiperativação ocorreu desacoplada da via UPR canônica, sem o aumento dos níveis da chaperona BiP ou indução do alvo transcricional clássico ERdj4. O splicing expressivo de XBP1 ocorreu na ausência de formação significativa de foci de 53BP1, demonstrando independência de quebras de fita dupla massivas. Ensaios de combinação revelaram que a pré-sensibilização das células com PNR-7-02 potencializa de forma sinérgica o efeito da TMZ. Assim, o tratamento com PNR-7-02 desencadeia uma ativação não-canônica e massiva do splicing de XBP1, independente da ativação de estresse de retículo. Os dados sugerem um papel de XBP1 como integrador de estresses celulares, com potencial regulação mediada por POLH.

Glioblastoma multiforme (GBM) is an aggressive tumor characterized by high resistance to genotoxic therapies, frequently evading DNA damage through repair and tolerance pathways. Among these, the translesion synthesis (TLS) pathway, mediated by Y-family DNA polymerases, plays a fundamental role in the replication of genetic material even in the presence of lesions. Evidence suggests an intersection between genomic instability and proteotoxic stress through the Unfolded Protein Response (UPR). The present study aimed to investigate the impact of pharmacological POLH inhibition on the regulation of the IRE1/XBP1 axis of the UPR in a glioblastoma model. A172 cells constitutively expressing the fluorescent reporters XBP1-mNeonGreen and Apple-53BP1trunc were exposed to treatments with PNR-7-02, Olaparib, Thapsigargin, and Temozolomide. Reporter activation was monitored by time-lapse and end-point microscopy. Gene and protein expressions were quantified by RT-PCR and Western Blot, respectively. As a result, POLH inhibition generated a massive and rapid accumulation of the processed isoform of the XBP1 reporter, surpassing the level induced by the positive control thapsigargin. This hyperactivation occurred decoupled from the canonical UPR pathway, without an increase in the levels of the BiP chaperone or induction of the classical transcriptional target ERdj4. The expressive XBP1 splicing occurred in the absence of significant 53BP1 foci formation, demonstrating independence from massive double-strand breaks. Combination assays revealed that pre-sensitizing cells with PNR-7-02 synergistically potentiated the effect of TMZ. As a conclusion, POLH inhibition triggers a massive and non-canonical activation of XBP1 splicing, independent of endoplasmic reticulum stress activation. The data suggest a role for XBP1 as an integrator of cellular stresses, with potential regulation mediated by POLH.