Papel da imunidade periférica após a hipóxia-isquemia e o tratamento com hipotermia terapêutica em ratos neonatos

Abstract

A hipotermia terapêutica (HT) é o tratamento padrão para reduzir a mortalidade e os déficits neurológicos após hipóxia-isquemia (HI) neonatal, uma condição que afeta recém-nascidos no mundo. No entanto, a HT não suprime completamente a neuroinflamação, levando a respostas neuroinflamatórias persistentes que podem exacerbar a lesão cerebral e limitar a eficácia da HT. Um dos processos ligados à neuroinflamação é a infiltração de células imunes periféricas, pouco investigadas na HI neonatal e após tratamento do HT. Além disso, a influência do dimorfismo sexual nesses desfechos ainda é pouco compreendida. No capítulo I, utilizamos uma metanálise para investigar o papel das células imunes periféricas na HI neonatal em ambos os sexos. No capítulo II, investigamos em experimento in vivo a reatividade microglial e astrocítica a curto e longo prazo em ratos neonatos machos e fêmeas após HI e tratamento com HT. No sétimo dia pós-natal (P7), filhotes machos e fêmeas foram submetidos à oclusão da artéria carótida comum direita, seguida de exposição à hipóxia (8% de O2). A HT foi induzida pela redução da temperatura corporal para 32°C por 5 horas. Os cérebros foram coletados no P8 ou P21 para avaliar o volume da lesão cerebral, o conteúdo de água cerebral e a reatividade astrocítica e microglial com base na intensidade média de fluorescência de GFAP e Iba-1. Os déficits comportamentais foram avaliados por meio de geotaxia negativa, discriminação olfativa e teste do cilindro. A metanálise demonstrou que a infiltração de diversos tipos de leucócitos se mostrou um fenômeno presente em diversos estudos utilizando modelos de HI neonatal, acompanhado de maiores lesões cerebrais, reatividade microglial e astrocítica e morte celular, bem como diminuição da sobrevivência neuronal. A infiltração de leucócitos, bem como a reatividade microglial e astrocítica, foram maiores nos machos do que nas fêmeas. Os experimentos in vivo mostraram que a HT não reduziu o volume da lesão, mas atenuou a perda de células neuronais em machos e reduziu o edema cerebral em fêmeas. A HT reduziu a reatividade microglial em machos em P8 e P21, e a reatividade astrocítica em machos apenas em P8. Prejuízos na discriminação olfativa foram observados nas fêmeas e foram prevenidos pela HT, enquanto os déficits de desempenho motor e os comprometimentos do desenvolvimento não foram prevenidos pela HT. Nossos resultados reforçam que a eficácia neuroprotetora da HT é limitada em lesões hipóxico-isquêmicas graves e que, apesar de reduzir a neuroinflamação precoce, a HT não consegue prevenir todas as respostas neuroinflamatórias a longo prazo. A HT exerceu um controle limitado da neuroinflamação crônica, podendo refletir uma ação ineficaz na inflamação estimulada pelas células imunes periféricas. Notavelmente, os efeitos anti-inflamatórios foram observados apenas em machos, ressaltando a necessidade de estratégias terapêuticas adicionais, particularmente para fêmeas.

Therapeutic hypothermia (TH) is the standard treatment to reduce mortality and neurological deficits following neonatal hypoxia–ischemia (HI), a condition that affects newborns worldwide. However, TH does not completely suppress neuroinflammation, leading to persistent neuroinflammatory responses that may exacerbate brain injury and limit the effectiveness of TH. One of the processes associated with neuroinflammation is the infiltration of peripheral immune cells, which has been poorly investigated in neonatal HI and following TH treatment. In addition, the influence of sexual dimorphism on these outcomes remains poorly understood. In Chapter I, we used a meta-analysis to investigate the role of peripheral immune cells in neonatal HI in both sexes. In Chapter II, we investigated, through in vivo experiments, short- and long-term microglial and astrocytic reactivity in male and female neonatal rats following HI and TH treatment. On postnatal day 7 (P7), male and female pups were subjected to right common carotid artery occlusion followed by exposure to hypoxia (8% O2). TH was induced by reducing body temperature to 32°C for 5 hours. Brains were collected at P8 or P21 to assess brain lesion volume, brain water content, and astrocytic and microglial reactivity based on the mean fluorescence intensity of GFAP and Iba-1. Behavioral deficits were assessed using negative geotaxis, olfactory discrimination, and the cylinder test. The meta-analysis demonstrated that infiltration of various types of leukocytes is a phenomenon present in multiple studies using neonatal HI models and is associated with increased brain injury, microglial and astrocytic reactivity, and cell death, as well as reduced neuronal survival. Leukocyte infiltration, as well as microglial and astrocytic reactivity, was greater in males than in females. In vivo experiments showed that TH did not reduce brain injury volume but attenuated neuronal cell loss in males and reduced cerebral edema in females. TH reduced microglial reactivity in males at P8 and P21 and astrocytic reactivity in males only at P8. Impairments in olfactory discrimination were observed in females and were prevented by TH, whereas motor deficits and developmental impairments were not prevented by TH. Our results reinforce that the neuroprotective efficacy of TH is limited in severe hypoxic–ischemic injuries and that, although it reduces early neuroinflammation, TH fails to prevent all long-term neuroinflammatory responses. TH exerted limited control over chronic neuroinflammation, which may reflect ineffective modulation of inflammation driven by peripheral immune cells. Notably, anti-inflammatory effects were observed only in males, highlighting the need for additional therapeutic strategies, particularly for females.