Efeitos de biotinta contendo medula espinal descelularizada e células-tronco mesenquimais na recuperação locomotora em um modelo murino de lesão raquimedular

Abstract

As lesões da medula espinal (LME) podem levar a disfunções neurológicas permanentes nos pacientes afetados, sem perspetiva de cura. A engenharia de tecidos propõe diversas abordagens terapêuticas visando a regeneração funcional do tecido após a lesão. Nesse contexto, a bioimpressão 3D apresenta-se como uma técnica promissora para a produção de biomateriais para o tratamento da LME, permitindo a fabricação de arcabouços 3D com capacidade de mimetizar o ambiente extracelular nativo da medula espinal e dar suporte para o transplante celular. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi produzir e caracterizar uma biotinta à base de medula espinal descelularizada e avaliar seus efeitos em um modelo de lesão da medula espinal. A medula espinal de ratos foi coletada e descelularizada utilizando detergentes iônicos. A eficiência da descelularização foi avaliada pela quantificação de DNA e lâminas histológicas coradas com hematoxilina e eosina, DAPI ou por imunoflorecência. O hidrogel base da biotinta foi produzido combinando alginato de sódio, gelatina e tecido descelularizado e o material foi caracterizado por análises reológicas, testes de inchaço e degradação, microscopia eletrônica de varredura e condutividade elétrica. Esse hidrogel foi exposto a macrófagos e a resposta inflamatória dos macrófagos foi avaliada pela quantificação de estresse oxidativo, teste de viabilidade celular, ELISA e citometria de fluxo. O material foi combinado com células para formar a biotinta e posteriormente foi bioimpresso. A citocompatibilidade da biotinta e posteriormente foi bioimpresso. A biocompatibilidade da biotinta foi avaliada por live/dead com células da linhagem PC12, um modelo neural amplamente utilizado, e células mesenquimais. Para os testes in vivo, foi utilizado um modelo de lesão da medula espinal por contusão em camundongos e os animais foram divididos em 4 grupos: lesão, hidrogel, biotinta e biotinta carregada com vesículas de células-tronco. Após 7 dias da lesão, os macrófagos da medula espinal dos animais foram isolados e foi realizado o sequenciamento de RNA. Além disso, os animais foram acompanhados por 42 dias para avaliação da melhora locomotora por meio da escada BMS e por grid walk. A quantificação de DNA e as análises histológicas demonstraram que a descelularização foi eficiente. O hidrogel apresentou um comportamento viscoelástico adequado para bioimpressão 3D e similar à medula espinal nativa. O material apresentou também uma alta porosidade e uma boa condutividade elétrica, taxa de degradação e inchaço. Macrófagos expostos ao hidrogel apresentaram um aumento na produção de IL-10 e na expressão de CD206, dois marcadores clássicos da polarização anti-inflamatória das células. Após a bioimpressão, a biotinta preservou uma alta viabilidade celular, em células PC12 e mesenquimais. A biotinta sem vesículas apresentou efeito imunomodulatório nos macrófagos 7 dias após a lesão, com aumento da expressão de genes anti-inflamatórios e síntese de proteínas relacionadas à função neural. Após 6 semanas da lesão/tratamento, a biotinta levou à regeneração locomotora dos animais, com melhora da motricidade ampla e fina. Os resultados encontrados demonstram o potencial da biotinta contendo medula espinal descelularizada como tratamento da LME.

Spinal cord injuries (SCI) can lead to permanent neurological dysfunction in affected patients, with no functional regeneration perspective. Tissue engineering proposes various therapeutic approaches ti achieve functional regeneration of tissue after an injury. In this context, 3D bioprinting emerges as a promising technique for the production of biomaterials for SCI treatment, allowing for the production of 3D scaffolds capable of mimicking the native extracellular environment of the spinal cord and supporting cell transplantation. Therefore, the aim of the present study was to produce and characterize a decellularized spinal cord-based bioink and to evaluate its effects in an in vivo SCI model. Rat spinal cord was collected and decellularized using ionic detergents. The efficiency of decellularization was evaluated by DNA quantification and histological slides stained with hematoxylin and eosin, DAPI, or byimmunofluorescence. The hydrogel base for the bioink was produced by combining sodium alginate, gelatin and decellularized tissue, and the material was characterized by rheological analyses, swelling and degradation tests, scanning electron microscopy, and electrical conductivity. This hydrogel was exposed to macrophages, and the macrophages' inflammatory response was assessed by quantifying oxidative stress, cell viability test, ELISA and flow cytometry. The material was combined with cells to prduce the bioink and was subsequently bioprinted. The bioink's cytocompatibility was evaluated by live/dead assay using PC12 cells, a widely used neural model, and mesenchymal cells. For the in vivo tests, a contusion spinal cord injury model in mice was used; the animals were divided into 4 groups: injury, bioink, bioink loaded with vesicles derived from stem cell, and hydrogel. Seven days after the injury, macrophages from spinal cord were isolated and RNA sequencing was performed. The animals were then monitored for 42 days to assess locomotor recovery using the Basso Mouse Scale (BMS) and the grid walk test. DNA quantification and histological slides demonstrated that decellularization was efficient. The hydrogel exhibited viscoelastic behavior suitable for 3D bioprinting and similar to native spinal cord. The material also showed high porosity, good electrical conductivity, and appropriated degradation and swelling rates. Macrophages exposed to the hydrogel showed an increase in IL-10 production and expression of CD206, two classic markers of anti-inflammatory cell polarization. After bioprinting, the bioink maintained high cell viability in both PC12 and mesenchymal cells. The bioink without vesicles exhibited an immunomodulatory effect on macrophages 7 days after the injury, with increased expression of anti-inflammatory genes and synthesis of proteins related to neural function. Six weeks after the injury/treatment, the bioink led to locomotor regeneration in the animals, with improvement in both gross and fine coordination. The results demonstrate the potential of bioink containing decellularized spinal cord tissue as a treatment for SCI.