Criopreservação de sêmen de abelhas-sem-ferrão - tubuna (Scaptotrigona bipunctata)

Abstract

As abelhas-sem-ferrão desempenham um papel essencial na manutenção da biodiversidade e na sustentabilidade dos ecossistemas, atuando como polinizadores fundamentais. No entanto, diversas espécies desse grupo encontram-se ameaçadas, tornando urgente o desenvolvimento de estratégias eficazes de conservação. A criopreservação de sêmen surge como uma ferramenta promissora para a preservação genética, permitindo o armazenamento a longo prazo e a aplicação em inseminação artificial. Embora essa técnica seja amplamente utilizada em mamíferos e tenha sido aplicada em Apis mellifera, sua implementação em abelhas-sem-ferrão é praticamente inexplorada. O objetivo do presente estudo foi investigar um protocolo de criopreservação para o sêmen de tubuna (Scaptotrigona bipunctata), uma espécie de abelha-sem-ferrão de ampla distribuição no Brasil. Para isso, a pesquisa foi estruturada em duas frentes complementares: uma revisão sistematizada da literatura sobre criopreservação de sêmen em abelhas (Artigo 1) e um estudo experimental (Artigo 2) voltado ao desenvolvimento e à avaliação de um protocolo específico para essa espécie. O Artigo 1 analisou estudos sobre criopreservação de sêmen de zangões, abordando aspectos como os principais crioprotetores, métodos de congelamento e descongelamento e parâmetros utilizados para a avaliação da qualidade espermática após criopreservação. Os principais parâmetros analisados na literatura foram a motilidade e a integridade da membrana, os quais apresentaram alterações após o processo de criopreservação. Estudos indicam que a combinação de crioprotetores permeáveis, como dimetilsulfóxido e etilenoglicol, com crioprotetores não permeáveis, como trealose, pode mitigar esses danos e melhorar a viabilidade espermática. No Artigo 2, testou-se a eficácia de dois diluentes (Diluente 1: solução de Hayes, 0,15 M NaCl, 1,80 mM CaCl₂, 2,68 mM KCl, 1,19 mM NaHCO₃, pH 8,7, 352 mOsmol/mL; Diluente 2: solução de citrato de sódio, 82,21 mM Na citrato, 24,87 mM NaHCO₃, 5,34 mM KCl, 0,35 mM penicilina G sódica, pH 8,1, 280 mOsmol/mL) em amostras de sêmen frescas e criopreservadas. Nas amostras criopreservadas, foram adicionados os seguintes agentes crioprotetores: 0,7 M dimetilsulfóxido, 0,9 M etilenoglicol e 0,05 M trealose. O sêmen foi obtido por dissecação das vesículas seminais dos zangões e submetido ao congelamento em vapor de nitrogênio líquido. A viabilidade pós-descongelamento foi avaliada por meio de testes de motilidade espermática, integridade de membrana celular (LIVE/DEAD®) e atividade mitocondrial (ensaio MTT). Os resultados mostraram que as amostras frescas diluídas na solução de Hayes apresentaram a maior taxa de motilidade espermática (22,83%), significativamente superior às amostras criopreservadas, cujas taxas foram inferiores a 10%. A viabilidade celular também foi maior nas amostras frescas (87,35%) em comparação com as criopreservadas (57,73% para a solução de Hayes e 41,80% para o Diluente 2). Embora a criopreservação tenha reduzido a motilidade e a viabilidade espermática, a atividade mitocondrial foi preservada, sugerindo que a funcionalidade celular pode ser mantida, apesar das perdas estruturais. Este estudo representa um avanço na criopreservação de sêmen de abelhas-sem-ferrão, sendo o primeiro a demonstrar a viabilidade dessa técnica em S. bipunctata. Os resultados sugerem que a criopreservação pode ser aplicada na reprodução assistida dessas abelhas, contribuindo para programas de conservação genética e manejo sustentável.

Stingless bees play an essential role in maintaining biodiversity and ecosystem sustainability, acting as key pollinators. However, several species within this group are threatened, making the development of effective conservation strategies increasingly urgent. Sperm cryopreservation emerges as a promising tool for genetic preservation, allowing long-term storage and application in artificial insemination. Although this technique is widely used in mammals and has been applied to Apis mellifera, its implementation in stingless bees remains largely unexplored. The aim of this study was to investigate a cryopreservation protocol for the semen of tubuna (Scaptotrigona bipunctata), a stingless bee species with a broad distribution in Brazil. To achieve this, the research was structured into two complementary approaches: a review of the literature on sperm cryopreservation in bees (Article 1) and an experimental study (Article 2) focused on the development and evaluation of a specific protocol for this species. Article 1 analyzed studies on drone sperm cryopreservation, addressing aspects such as the main cryoprotectants, freezing and thawing methods, and parameters used to assess sperm quality after cryopreservation. The primary parameters analyzed in the literature were motility and membrane integrity, both of which exhibited changes after the cryopreservation process. Studies indicate that the combination of permeable cryoprotectants, such as dimethyl sulfoxide and ethylene glycol, with non-permeable cryoprotectants, such as trehalose, can mitigate these damages and improve sperm viability. In Article 2, the efficacy of two extenders (Extender 1: Hayes solution, 0.15 M NaCl, 1.80 mM CaCl₂, 2.68 mM KCl, 1.19 mM NaHCO₃, pH 8.7, 352 mOsmol/mL; Extender 2: sodium citrate solution, 82.21 mM Na citrate, 24.87 mM NaHCO₃, 5.34 mM KCl, 0.35 mM sodium penicillin G, pH 8.1, 280 mOsmol/mL) was tested in fresh and cryopreserved semen samples. In the cryopreserved samples, the following cryoprotective agents were added: 0.7 M dimethyl sulfoxide, 0.9 M ethylene glycol, and 0.05 M trehalose. Semen was obtained by dissecting the seminal vesicles of drones and subjected to freezing in liquid nitrogen vapor. Post-thaw viability was assessed through sperm motility tests, membrane integrity (LIVE/DEAD®), and mitochondrial activity (MTT assay). The results showed that fresh samples diluted in Hayes solution exhibited the highest sperm motility rate (22.83%), significantly higher than the cryopreserved samples, whose rates were below 10%. Cell viability was also higher in fresh samples (87.35%) compared to cryopreserved samples (57.73% for Hayes solution and 41.80% for Extender 2). Although cryopreservation reduced sperm motility and viability, mitochondrial activity was preserved, suggesting that cellular functionality can be maintained despite structural losses. This study represents a significant advancement in stingless bee sperm cryopreservation, being the first to demonstrate the feasibility of this technique in S. bipunctata. The results suggest that cryopreservation can be applied in the assisted reproduction of these bees, contributing to genetic conservation programs and sustainable management.