Comparação entre métodos de segregação espermática pós-descongelamento para a avaliação do status de capacitação acrossomal em sêmen bovino congelado

Abstract

A capacitação espermática é definida como uma série de eventos que o espermatozoide sofre para adquirir a habilidade de fecundar, porém, este processo deve ocorrer no momento e local corretos, caso contrário, as células poderão não sobreviver até o momento da fecundação. O objetivo deste estudo foi identificar um método de segregação espermática com baixa influência na indução da capacitação espermática de sêmen bovino congelado para adequada avaliação do status acrossomal da amostra. Foram testados três métodos de segregação: lavagem espermática, gradiente de mini-Percoll® e swim up, aplicados a doses de sêmen congelado de três touros. Foram utilizados diferentes tempos e velocidades de centrifugação para o mini-Percoll® e para a lavagem, e diferentes meios para a lavagem (Sperm-TALP sem albumina, e PBS). Após a segregação, foram avaliados parâmetros de motilidade e vigor de motilidade (M/V), viabilidade por coloração de azul de tripano e Giemsa (ATG) e pelo teste hiposmótico (HOST), hiperativação, aglutinação e avaliação do status do acrossoma por coloração com clortetraciclina (CTC). As amostras de cada touro responderam de forma distinta aos métodos de segregação. Em geral, a menor proporção de células capacitadas (CA) foi observada após a segregação pela lavagem e pelo mini-Percoll®. Pós-segregação, as amostras foram divididas em grupo controle (Sperm-TALP sem heparina) e grupo indução (Fert-TALP com 10 UI/mL de heparina) para avaliar o comportamento das células à presença de heparina após 0, 15 e 120 min de incubação. As amostras segregadas por mini-Percoll® e por lavagem incubadas com heparina apresentaram aumento na proporção de células CA e com reação acrossomal (RA), não havendo uma resposta imediata nas amostras segregadas pelo swim up. Houve perda de qualidade e viabilidade em função do tempo, aumentando a proporção de células CA. Não houve influência dos meios da lavagem no status do acrossoma, porém, as amostras submetidas à menor força g se apresentaram mais estáveis à indução da capacitação. Houve uma importante variabilidade individual entre os touros, com um touro sendo mais resistente à indução da capacitação pela segregação, outro apresentando uma resistência intermediária para capacitação, mas alta para a RA, e o terceiro sendo mais sensível e susceptível à ocorrência da capacitação. Entretanto, os métodos de menor perturbação ao status acrossomal entre os touros foram a lavagem e o mini-Percoll®. Por fim, observou-se que quanto maior a proporção de células espermáticas CA, menor a viabilidade in vitro ao longo do tempo, e vice-versa, o que pode ser relevante para a fertilidade a campo, quando utilizado sêmen bovino congelado para a inseminação artificial (IA).

Sperm capacitation is defined as a series of events that the sperm undergoes to acquire the ability to fertilize. However, this process must occur at the right time and place; otherwise, the cells may not survive until fertilization. The aim of this study was to identify a sperm segregation method with low influence on the induction of sperm capacitation in frozen bovine semen for an adequate evaluation of the acrosomal status of the sample. Three distinct segregation methods were tested, including sperm washing, mini-Percoll® gradient, and swim-up, tested in doses of frozen semen from three bulls. Different centrifugation times and g forces were used for mini-Percoll® and sperm washing, and different media for washing (Sperm-TALP without albumin, and PBS). After segregation, motility and motility vigor parameters (M/V), cell viability by trypan blue and Giemsa staining (ATG) and by hypoosmotic swelling test (HOST), hyperactivation, agglutination, and evaluation of acrosome status by chlortetracycline staining (CTC) were evaluated. The samples from each bull responded differently to the segregation methods, but overall, the lowest proportion of capacitated cells (CA) was observed after segregation by washing and mini-Percoll®. After segregation, samples were divided into control group (Sperm-TALP without heparin) and induction group (Fert-TALP with 10 IU/mL heparin) to evaluate cell behavior in the presence of heparin after 0, 15, and 120 min of incubation. Samples segregated by mini-Percoll® and washing and incubated with heparin showed an increase in the proportion of CA cells and with acrosome reaction (AR), with no immediate response in samples segregated by swim-up. A loss of quality and viability was observed over time, with an increase in the proportion of CA cells. The different media used for washing did not influence the acrosome status, however, the samples subjected to lower centrifugal force were more stable to capacitation induction. A significant individual variability was observed between bulls, with one bull being more resistant to capacitation induction by segregation, another showing intermediate resistance to capacitation but high for AR, and a third being more sensitive and susceptible to capacitation. However, the least perturbing segregation methods to the acrosomal status between bulls were washing and mini-Percoll®. Finally, it was observed that the higher the proportion of CA sperm cells, the lower the in vitro cell viability over time, and vice versa, which may be relevant to fertility when using frozen bovine semen for artificial insemination (AI).