Efeitos de ginsenosideo Rb1 sobre parâmetros mitocondriais de células dopaminérgicas SHSY-5Y de neuroblastoma humano expostas ao clorpirifós

Abstract

A disfunção mitocondrial consiste na falha do sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS), além de incluir danos diversos no DNA mitocondrial (mtDNA), aumento na produção de espécies reativas ocasionado pela oxidação, glicação e/ou nitração de componentes da cadeia transportadora de elétrons (CTe), podendo contribuir com a queda na produção de adenosina trifosfato (ATP). Além disso, há também maior geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) encontrados em desordens relacionadas a função mitocondrial, que interagem no estabelecimento de um estado pró inflamatório exacerbando a disfunção mitocondrial. Assim, a função mitocondrial tem se relacionado ao processo inflamatório por induzir morte em diferentes tecidos e podendo ainda ser ativada por toxicantes e poluentes ambientais. Neste contexto, o agroquímico clorpirifós (CPF; C₉H₁₁Cl₃NO₃PS) tem sido estudado por interferir na bioenergética e ocasionar desequilíbrio redox, sendo assim um toxicante mitocondrial. O CPF tem ação pró-oxidante pois, induz a produção de ERO e espécies reativas de nitrogênio (ERN), além de promover o estímulo da perda de potencial de membrana mitocondrial (PMM) e queda nos níveis de ATP. Outro alvo do CPF é a enzima citoprotetora heme oxigenasse-1 (HO-1), o CPF estimula negativamente a HO-1 facilitando o colapso mitocondrial uma vez que contribui na ativação do processo inflamatório. A HO-1 degrada a heme que gera ferro livre, monóxido de carbono (CO), e bilirrubina convertida em bilirrubina (BVR), moléculas essenciais na defesa antioxidante. Neste sentido, avaliamos os efeitos do ginsenosídeo Rb1 (Rb1; C₅₄H₉₂O₂₃) de Panax ginseng C.A. Mayer (Araliacea), já descrito com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias até mesmo em doenças neurológicas. Avaliamos diferentes doses de Rb1 (10-100 μg/mL) diante da intoxicação ao CPF (10-100 μM) na linhagem dopaminérgica SH-SY5Y. Utilizou-se, então, a concentração de 100 μM de CPF como padrão, e 50 μg/mL de Rb1 como estratégia de frear a intoxicação ocasionada pelo CPF. O Rb1 na concentração de 50 μg/mL preveniu eficientemente o dano causado na viabilidade celular (p <0,05), também preveniu a perda de integridade da membrana diminuindo o extravamento da enzima lactato desidrogenase (LDH) (p < 0,01). Utilizou-se, então, a concentração de 100 μg/mL de Rb1 para verificar a atividade da enzima HO-1, o Rb1 induziu aumento na atividade de HO-1 (p < 0,05), enquanto que o CPF levou a queda de HO-1 (p < 0,05), então, avaliamos a ação do Rb1 durante o bloqueio da HO-1 pelo inibidor protoporfirina de zinco IX (ZnPP-IX), verificamos que o Rb1 não induziu citoproteção (p < 0,01). Em contraponto, sem o boqueio de HO-1, Rb1 preveniu a disfunção mitocondrial atenuando a queda do PMM (p < 0,01) além de diminuir os impactos causados pelo CPF na produção de ATP (p < 0,01). Da mesma forma, Rb1 preveniu o aumento nos níveis de TNF-α (p < 0,05) e IL-1β (p < 0,01) demonstrando uma ação anti-inflamatória. Além disso, também preveniu a perda do PMM (p < 0,05), da elevação de TNF-α (p < 0,05) e viabilidade celular (p < 0,05), sugerindo uma relação entre proteção mitocondrial, ação anti-inflamatória e citoproteção. Por fim, o mito-TEMPO um mimético da enzima Mn-SOD atenuou a disfunção mitocondrial na presença de CPF (p < 0,05), reduzindo também a inflamação pela queda de TNF-α e da viabilidade celular (p < 0,05). Portanto, com os dados aqui apresentados, sugere-se que o Rb1 pode atuar como agente de proteção mitocondrial por mecanismo que parece envolver a enzima HO-1. Pesquisas futuras elucidarão a possibilidade de prevenção de um ciclo vicioso entre disfunção mitocondrial e inflamação ser arte relevante na citoproteção induzida pelo Rb1.

Mitochondrial dysfunction consists of the failure of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS), in addition to including various damages to mitochondrial DNA (mtDNA), increased production of reactive species caused by oxidation, glycation, and/or nitration of components of the electron transport chain (ETC). This may contribute to the drop in the production of adenosine triphosphate (ATP). Furthermore, there is also increased generation of reactive oxygen species (ROS) found in disorders related to mitochondrial function, which interact in the establishment of a pro-inflammatory state exacerbating mitochondrial dysfunction. Thus, mitochondrial function has been related to the inflammatory process by inducing death in different tissues and can also be activated by toxicants and environmental pollutants. In this context, the agrochemical chlorpyrifos (CPF; C9H11Cl3NO3PS) has been studied for interfering in bioenergetics and causing redox imbalance, thus being a mitochondrial toxicant. CPF has a pro-oxidant action because it induces the production of ROS and reactive nitrogen species (RNS), in addition to promoting the stimulation of the loss of mitochondrial membrane potential (MMP) and a drop in ATP levels. Another target of CPF is the cytoprotective enzyme heme oxygenase-1 (HO-1), CPF negatively stimulates HO-1 facilitating mitochondrial collapse as it contributes to the activation of the inflammatory process. HO-1 degrades heme, which generates free iron, carbon monoxide (CO), and bilirubin converted to bilirubin (BVR), essential molecules in antioxidant defense. In this sense, we evaluated the effects of ginsenoside Rb1 (Rb1; C54H92O23) from Panax ginseng C.A. Mayer (Araliacea), already described with antioxidant and anti-inflammatory properties even in neurological diseases. We evaluated different doses of Rb1 (10-100 μg/mL) against CPF intoxication (10-100 μM) in the dopaminergic SH-SY5Y cell line. A concentration of 100 μM of CPF was used as a standard, and 50 μg/mL of Rb1 was used as a strategy to combat intoxication caused by CPF. Rb1 at a concentration of 50 μg/mL efficiently prevented the damage caused to cellular targets (p <0.05), and also prevented the loss of membrane integrity by avoiding the leakage of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH) (p <0.01). A concentration of 100 μg/mL of Rb1 was then used to verify the activity of the HO-1 enzyme. Rb1 induced an increase in HO-1 activity (p < 0.05), while CPF led to a decrease in HO-1 (p < 0.05). We then evaluated the action of Rb1 during HO-1 blockade by the zinc protoporphyrin IX inhibitor (ZnPP-IX), and found that Rb1 did not induce cytoprotection (p < 0.01). In contrast, without HO-1 blockade, Rb1 prevented mitochondrial dysfunction by attenuating the decrease in PMM (p < 0.01) in addition to decreasing the impacts of CPF on ATP production (p < 0.01). Likewise, Rb1 prevented the increase in TNF-α (p < 0.05) and IL-1β (p < 0.01) levels, demonstrating an anti-inflammatory action. Furthermore, it also prevented the loss of PMM (p < 0.05), the elevation of TNF-α (p < 0.05) and cellular predictions (p < 0.05), indicating a relationship between mitochondrial protection, anti-inflammatory action and cytoprotection. Finally, mito-TEMPO, a mimic of the Mn-SOD enzyme, attenuated mitochondrial dysfunction in the presence of CPF (p < 0.05), also reducing inflammation by decreasing TNF-α and cellular predictions (p < 0.05). Therefore, the data presented here suggest that Rb1 may act as a mitochondrial protection agent by a mechanism that appears to involve the HO-1 enzyme. Future research will elucidate the possibility that preventing a vicious cycle between mitochondrial dysfunction and inflammation may be a relevant art in Rb1-induced cytoprotection.