Caracterização gênica de cepas de Escherichia coli causadoras de endometrite em éguas

Abstract

O papel da Escherichia coli na patogenia da endometrite equina é em grande parte desconhecida. Sugere-se que a E. coli induz uma resposta inflamatória menos exsudativa e provoca uma maior lesão no tecido endometrial do que S. zooepidemicus. Além disso a infecções por E. coli são relatadas como as mais problemáticas a resolver. Dessa forma, a determinação de fatores de virulência da E. coli pode ser um ponto fundamental para caracterizar cepas que induzam uma maior resposta inflamatória e de que forma a sua composição antigênica tenha um comportamento de autodefesa, tornando-a difícil de ser isolada e até mesmo eliminadas do ambiente uterino por mecanismos de defesas celulares. Dessa forma os objetivos do trabalho foi verificar a ocorrência de genes de virulência e toxicidade em isolados de E. coli. Comparar a frequência dos genes de virulência Stx1, Stx2, eaeA, ehxA, hlyA, iuc, ibeA, fimH, kpsmII em amostras de E. coli isoladas do útero, de fezes e da vulva; estabelecer relação entre a presença de E.coli, com a sintomatologia clínica e seus fatores de virulência 24 horas após infecção experimental em éguas. Além de verificar a produção de biofilme in vitro, e identificação dos filogrupos patogênicos e não patogênicos das E.coli isoladas. Dessa forma, em relação à porcentagem de presença de cada gene estudado: Stx1 (28,57%); Stx2 (57,14%); eaeA (14,28%); ehxA (14,28%); hlyA (28,57%); iuc (28,57%); ibeA (14,28%); fimH (85,71%); KpsMII (14,28%). cepa I - iuc; cepa II – stx2, hlyA e fimH; cepa III – stx2 e fimH; cepa IV – Stx1, eaeA, iuc e fimH; cepa V cepa Stx2, hlyA, ibeA, fimH, KpsMII; a cepa VI apresentou somente o gene fimH; e a cepa VII identificou os genes Stx1, Stx2, ehxA, fimH. Na formação de biofilme in vitro, a cepa VI teve leve produção de biofilme, e cepa V produção forte de biofilme, além de possuir maior número de genes do estudo (hlyA, Stx2, fimH, kpsmII, ibeA). Estas cepas isoladas foram inoculadas experimentalmente em 6 éguas diferentes, clinicamente normais com exame citológico e bacteriológicos negativos. Um dia após a infecção, foi realizado exame clínico do trato genital incluindo, ultrassonografia, citologia endometrial e bacteriologia. A endometrite causada pelas E.coli provocou citologia positiva e as éguas desenvolveram sinais clínicos vaginais de endometrite e líquido uterino. O gene do fator de virulência fimH foi o mais prevalente e o mais significativo, entre as E.coli na infecção intrauterina equina.No entanto, somente a cepa com presença do gene KpsMII, apresentou forte produção de biofilme. Na interpretação do grupo filogenico das amotras de E.coli estudadas, a maioria das cepas fazem parte do grupo A e B1, dessa forma, denominadas por cepas comensais. Os dados apresentados neste trabalho indicam que isolados de E.coli recuperados do útero de éguas apresentam ampla diversidade genética. Mesmo que a maioria das cepas de E.coli estudadas façam parte do grupo filogênico de comensais, éguas que não apresentaram presença de liquido , e crescimento bacteriano , não é indicativo de égua saudável, devido à presença de neutrófilos no exame citológico, o que pode ser devido a produção de biofilme dessas cepas.

The role of Escherichia coli in the pathogenesis of equine endometritis is largely unknown. It is suggested that E. coli induces a less exudative inflammatory response and causes greater damage to the endometrial tissue compared to Streptococcus zooepidemicus. Moreover, E. coli infections are reported as the most challenging to resolve. Therefore, determining the virulence factors of E. coli may be crucial to characterize strains that induce a greater inflammatory response and how their antigenic composition exhibits self-defense behavior, making them difficult to isolate and even eliminate from the uterine environment by cellular defense mechanisms. Thus, the objectives of the study were to verify the occurrence of virulence and toxicity genes in E. coli isolates, compare the frequency of virulence genes Stx1, Stx2, eaeA, ehxA, hlyA, iuc, ibeA, fimH, kpsmII in samples of E. coli isolated from the uterus, feces, and vulva, establish a relationship between the presence of E. coli, clinical symptoms, and their virulence factors 24 hours after experimental infection in mares. Additionally, the study aimed to assess biofilm production in vitro and identify the pathogenic and non-pathogenic phylogroups of the isolated E. coli. The results showed the following percentages of gene presence: Stx1 (28.57%); Stx2 (57.14%); eaeA (14.28%); ehxA (14.28%); hlyA (28.57%); iuc (28.57%); ibeA (14.28%); fimH (85.71%); KpsMII (14.28%). Strain I - iuc; Strain II – stx2, hlyA, and fimH; Strain III – stx2 and fimH; Strain IV – Stx1, eaeA, iuc, and fimH; Strain V – Stx2, hlyA, ibeA, fimH, KpsMII; Strain VI presented only the fimH gene; and Strain VII identified the genes Stx1, Stx2, ehxA, fimH. In in vitro biofilm formation, Strain VI showed slight biofilm production, and Strain V exhibited strong biofilm production, in addition to having the highest number of genes studied (hlyA, Stx2, fimH, kpsmII, ibeA). These isolated strains were experimentally inoculated into 6 different mares, which were clinically normal with negative cytological and bacteriological exams. One day after infection, a clinical examination of the genital tract, including ultrasonography, endometrial cytology, and bacteriology, was performed. Endometritis caused by E. coli resulted in positive cytology, and the mares developed clinical signs of vaginal endometritis and uterine fluid. The fimH virulence factor gene was the most prevalent and significant among E. coli in equine intrauterine infection. However, only the strain with the KpsMII gene showed strong biofilm production. In the interpretation of the phylogenetic group of the E. coli samples studied, most belong to groups A and B1, thus classified as commensal strains. The data presented in this work indicate that E. coli isolates recovered from the uterus of mares exhibit a wide genetic diversity. Even though most of the strains studied belong to the commensal phylogenetic group, mares without fluid presence or bacterial growth are not necessarily healthy, due to the presence of neutrophils in the cytological exam, which may be due to biofilm production by these strains.