Caracterização fenotípica e genotípica de linhagens de Salmonella spp. envolvidas em surtos alimentares ocorridos no Rio Grande do Sul nos anos de 1999 a 2000

Abstract

Salmonella é uma das mais importantes causas de doenças veiculadas por alimentos em todo o mundo, sendo também reconhecida como o principal agente responsável por toxinfecções no Estado do Rio Grande do Sul, na última década. Neste trabalho utilizamos diferentes técnicas fenotípicas e genotípicas para caracterizar amostras de Salmonella isoladas de alimentos envolvidos em surtos de origem alimentar ocorridos no Rio Grande do Sul, durante os anos de 1999 e 2000. Em uma primeira etapa, as amostras foram sorotipificadas e submetidas à análise por PCR para a verificação da presença do gene regulatório spvR (Salmonella plasmid virulence). Resultados indicaram que dentre 75 isolados, 73 (97%) foram classificadas como S. Enteritidis e 2 isolados foram sorotipificados como S. Derby e S. Typhimurium. Em relação à presença do gene spvR, 62 amostras (82,7%) obtiveram resultado positivo e a correlação positiva (P <0.05) entre as amostras de S. Enteritidis e a presença do gene spvR foi determinada. Em uma segunda etapa, o perfil de resistência aos antimicrobianos das amostras de S. Enteritidis foi determinado. Os isolados foram testados individualmente contra 10 antimicrobianos usando a técnica de difusão em disco. A maioria dos isolados foi susceptível a todos os antimicrobianos testados. Um predomínio de resistência foi verificado para estreptomicina (37%), gentamicina (13,7%) e ácido nalidíxico (13,7%), enquanto que, resistência intermediária foi observada para tetraciclina (53,4%), neomicina (30,1%) e gentamicina (15,1%). Valores de resistência foram encontrados em 40 isolados (54%), o qual foram agrupados em 15 diferentes perfis. Resistência múltipla foi presente em 17 (23%) isolados, sendo que um isolado demonstrou resistência a quatro antimicrobianos. Em uma terceira etapa do trabalho, amostras de S. Enteritidis foram tipificadas por PCR-ribotipificação. Um fragmento de 600pb presente em todas as amostras foi sequenciado em 26 isolados escolhidos aleatoriamente. A análise de PCR-ribotipificação gerou apenas 2 perfis (R1 and R2) dentre todas as amostras e o sequenciamento de DNA demonstrou 98 a 100% de similaridade entre as amostras testadas. O sequenciamento de DNA confirmou a similaridade genética observada na PCR-ribotipificação. A ocorrência de deleções e ou inserções foi a provável explicação para as diferenças encontradas nas seqüências de nucleotídeos, além da presença de genes de tRNA-Ala e tRNA-Ile. A presença de genes de tRNA-Glu não foi verificada. Com base nesses resultados, acredita-se que uma linhagem específica de S. Enteritidis ou linhagens muito relacionadas deste microrganismo estejam envolvidas em surtos de salmonelose ocorridos em diferentes cidades do Rio Grande do Sul.

Salmonella is one of the major causes of foodbome diseases worldwide, and have been also recognized as the main bacterial agent responsible for food poisoning in Rio Grande do Sul State, in the last decade. In this study we used different phenotypic and genotypic techniques to characterize Salmonella strains isolated from foods involved in foodbome outbreaks occurred in Rio Grande do Sul, during 1999 to 2000. Firstly, strains were serotyped and submitted to PCR analysis to verify the prevalence of Salmonella plasmid virulence (spvR) regulatory gene. Results indicated that among the 75 isolates, 73 (97%) were classified as S. Enteritidis and 2 isolates were serotyped as S. Derby and S. Typhimurium. Regarding the prevalence of spvR gene, 62 strains (82, 7%) were PCR positive, and a positive correlation (P <0.05) between the strains of S. Enteritidis and the presence of spvR gene was demonstrated. In the second part of this work, the antimicrobial resistance for the S. Enteritidis isolates was determined. The isolates were individually tested against 10 antimicrobial agents using a disk diffusion technique. Most isolates were susceptible to all drugs tested. The predominant resistance observed was to streptomycin (37%), gentamicin (13.7%), and nalidixic acid (13.7%), while intermediate resistance was mostly observed for tetracycline (53.4%), neomycin (30.1%), and gentamicin (15.1%). Resistance was verified in 40 isolates (54%), which were grouped in 15 different pattems. Multiple resistance was presented in 17 (23%) of the isolates, and one isolate exhibited resistance to four drugs. In the thirth part of this work, S. Enteritidis isolates were typing by PCR-ribotyping. An amplicon of 600 bp present in the banding pattems of all the isolates was sequenced in 26 randomly chosen strains. PCR-ribotyping analysis demonstrated only two banding profiles (R1 and R2) for all the samples, and DNA sequencing presented 98 to 100% of similarity among the strains tested. DNA sequencing confirmed the genetic similarity among the strains verified by PCR-ribotyping. The occurrence of deletions/insertions is the probable explanation for the differences encountered in the nucleotide sequences, which presented tRNA-Ala and tRNA-Ile genes, but not tRNA-Glu gene. Based on the results, we believe that a specific strain of S. Enteritidis, or a very closely related clones of this microorganism was involved with salmonellosis outbreaks occurred in diverse cities ofRio Grande do Sul State.