Identificação e caracterização molecular de mutações e polimorfismos no gene da fenilalanina hidroxilase em fenilcetonúricos do sul do Brasil

Abstract

A Hiperfenilalaninemia (HPA) decorrente da deficiência da fenilalanina hidroxilase (PAH) é um distúrbio metabólico herdado de modo autossômico recessivo. O gene da PAH localiza-se na região q22-q24.1 do cromossomo 12 e abrange 90 kb de DNA dividido em 13 exons, os quais codificam um mRNA de aproximadamente 2,4 kb. Até o momento, 412 diferentes alterações foram identificadas no locus da PAH. A grande heterogeneidade molecular observada neste gene pode estar ligada à variabilidade do fenótipo nos pacientes com HPA por deficiência de PAH. O presente estudo teve como objetivos principais determinar a freqüência das mutações e estabelecer uma correlação entre os dados bioquímicos e clínicos com as alterações moleculares encontradas nos pacientes com HPA por deficiência de PAH no Sul do Brasil. A amostra foi composta por 30 pacientes não relacionados que se encontram em tratamento no Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Este estudo foi aprovado pela Comissão Científica e pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde do HCPA, estando adequado ética e metodologicamente, de acordo com as Normas de Pesquisa em Saúde (resolução 01 /88 do Conselho Nacional de Saúde). O protocolo aplicado compreendeu a extração de DNA e posterior amplificação por PCR de 13 fragmentos do gene da PAH. Os produtos de PCR foram analisados pela técnica de polimorfismos conformacionais de cadeia simples (SSCP). As amostras que apresentaram padrões de mobilidade eletroforética alterados foram submetidas à análise por digestão com endonucleases de restrição específicas e/ou seqüenciamento. Os pacientes foram classificados em subgrupos (PKU leve, PKU moderada e PKU clássica), de acordo com a tolerância à Phe quando em dieta controlada. A técnica de SSCP permitiu a identificação de 25 pacientes (83,3%) com alterações nos fragmentos analisados do gene da PAH. Neste estudo, foram encontradas 24 alterações diferentes, sendo identificados 26 genótipos distintos associados à HPA por deficiência de PAH. A análise com endonucleases de restrição possibilitou a detecção de 8 mutações (I65T, R252W, R261Q, R261X, IVS10nt-11g>a, V388M, R408W e IVS12nt1g>a). O seqüenciamento direto permitiu a detecção de 16 alterações, sendo 10 mutações associadas à doença (L15/S16fsdelCT, IVS2nt5g>c, F55fsdelT, IVS2nt-13t>g, N133/Q134fsdelATCA, R158Q, R270K, P281L, IVS7nt1g>a e R408Q), 4 polimorfismos (IVS2nt19t>c, V245V, Y414Y e IVS12nt-35c>t) e duas alterações novas no gene da PAH: 1378g>t e IVS12nt-15t>c. As técnicas empregadas neste estudo permitiram a identificação de pelo menos um alelo mutante em todos os pacientes analisados e o genótipo foi determinado em 23 dos 30 pacientes. A freqüência de mutações identificadas neste estudo foi de 87,3% (48/55) e as mais freqüentes foram a I65T (18,2%), a R261X (9,1%), a R408W (9,1%), a IVS2nt5g>c (7,3%), a R261Q (7,3%) e a V388M (7,3%). As mutações raras apresentaram freqüências variando entre 1,8% e 5,5%. A presença de polimorfismos foi observada em 46,6% dos pacientes com HPA por deficiência de PAH, sendo os polimorfismos IVS2nt19t>c, V245V e IVS12nt-35c>t os mais freqüentes. O espectro de mutações encontrado em nossos pacientes é diferente do observado em pacientes de outros países da América Latina, confirmando a heterogeneidade molecular desta doença. Não foi estabelecido uma correlação entre os valores de atividade residual prevista (ARP) para a fenilalanina hidroxilase com os parâmetros clínicos e bioquímicos, tanto em pacientes com diagnóstico precoce como tardio. Mas foi, no entanto, observada uma correlação entre os valores de ARP e os níveis de Tyr durante o tratamento em pacientes com diagnóstico precoce, indicando que os mesmos podem exercer um papel importante no controle da dieta e na determinação do fenótipo dos pacientes. A análise de regressão linear simples mostrou uma forte relação entre a tolerância à Phe da dieta e os níveis de Phe pré e durante o tratamento, permitindo a classificação fenotípica dos pacientes com diagnóstico precoce. Esta análise mostrou também uma associação significativa entre a tolerância à Phe da dieta e os níveis de Phe durante o tratamento, permitindo também a determinação do fenótipo na maioria dos pacientes com diagnóstico tardio. Estes resultados ressaltam a importância do diagnóstico precoce e de um adequado controle dietético em pacientes com HPA por deficiência de PAH. Os níveis de Phe e Tyr não foram capazes de determinar a gravidade de mutações em heterozigotos para HPA por deficiência de PAH, tanto na situação de jejum como após a sobrecarga de aspartame. Nas duas situações testadas, as relações Phe/Tyr e Phe2/Tyr foram consideradas os melhores parâmetros para discriminar indivíduos heterozigotos e controles. Este estudo se constitui numa contribuição original ao conhecimento das bases moleculares da HPA por deficiência de PAH no Sul do Brasil, trazendo informações relevantes para o melhor entendimento da relação genótipo-fenótipo neste distúrbio.

Hyperphenylalaninemia (HPA) due to phenylalanine hydroxylase (PAH) deficiency is a disorder inherited as an autosomal recessive trait. The locus of the PAH gene is located on chromosome 12, region q22-q24.1, and spans 90 kb of genomic DNA divided into 13 exons, which is transcribed into a mRNA of 2.4 kb. To date, 412 different alterations were identified in the PAH gene. The wide variation of phenotype observed among patients with PAH deficiency might be due to high molecular heterogeneity. The aims of the present study were to determine the frequency of mutations and to establish a correlation between biochemical, clinical and molecular data from patients with HPA due to PAH deficiency from South Brazil. The sample was composed by 30 unrelated patients under treatment in the Medical Genetics Service of Clinica! Hospital of Porto Alegre (HCPA). This study was approved by the Scientific Committee and Research and Ethical in Health Committee, being ethically and methodologically suitable, and according to Principies of Research in Health (resolution 01/88 of Health National Counsel). The protocol applied consisted of PCR amplification of 13 fragments of PAH gene following DNA extraction. The PCR products were analysed by strand single conformational polymorphisms (SSCP) analysis. The fragments showing abnormal patterns of electrophoretic mobility were submitted to restriction endonucleases and/or direct sequencing analyses. The patients were classified in subgroups (mild PKU, moderate PKU and classical PKU), according to Phe tolerance when controlled diet. The SSCP technique allowed the identification of 25 patients (83.3%) with alterations in fragments analysed of the PAH gene. ln this study, 24 different alterations were detected, being identified 26 distinct genotypes associated to HPA due to PAH deficiency. Restriction endonuclease analysis permitted the detection of 8 mutations (I65T, R252W, R261Q, R261X, IVS10nt-11g>a, V388M, R408W and IVS12nt1g>a). Sequencing analysis allowed the detection of 16 alterations, being 10 disease associated mutations (L 15/S16fsdelCT, IVS2nt5g>c, F55fsdeIT, IVS2nt-13t>g, N133/Q134fsdeIATCA, R158Q, R270K, P281 L, IVS7nt1 g>a, R408Q), 4 polymorphisms (IVS2nt19t>c, V245V, Y414Y and IVS12nt-35c>t) and 2 novel alterations in PAH gene: 1378g>t and IVS12nt-15t>c. The methods applied in this study allowed the identification of at least one mutant allele in all patients studied and genotype was established in 23 out of 30 patients. The frequency of mutations identified in this study was 87.3% (48/55) and most frequent mutations were I65T (18.2%), R261X (9.1 %), R408W (9.1 %), IVS2nt5g>c (7.3%), R261 Q (7.3%) and V388M (7.3%). Rare mutations showed frequencies ranging from 5.5% and 1.8%. Polymorphisms were seen in 46.6% of patients with HPA due to PAH deficiency, and most frequent were IVS2nt19t>c, V245V and IVS12nt-35c>t. The spectrum of mutations observed in our patients is different from the observed in patients from other Latin American countries, confirming the molecular heterogeneity of this disease. A correlation between values of predicted residual PAH activity (PRA) and clinical and biochemical parameters was not established, in patients with both early or late diagnostic. However, a correlation between the values of PRA and Tyr levels during treatment in patients with early diagnostic was observed, showing that Tyr levels can perform an important function in diet control and in patients phenotype determination. The simple linear regression analysis showed a strong correlation between Phe tolerance and Phe levels before and during treatment, allowing a phenotypic classification of patients with early diagnostic. On the other hand, this analysis showed only a significant correlation between Phe tolerance and Phe levels during treatment, allowing phenotype determination at majority of the patients with late diagnostic. This data demonstrated the importance of an early diagnostic and suitable dietary control in patients with HPA due to PAH deficiency. Plasma Phe and Tyr concentrations did not predict severity of mutations in obligate heterozygotes for HPA due to PAH deficiency, both in fasting state and after aspartame loading test. ln these two situations, Phe/Tyr and Phe2/Tyr ratios were considered good parameters to discriminate controls from heterozygotes. This study is an original contribution to the understanding of molecular bases of the HPA due to PAH deficiency in South Brazil, providing important information for a better knowledge of genotype-phenotype correlation in this group of disease.