Alteração do fluxo de cálcio em microssomas do cérebro por K+, Na+ e H+ : modulação por polissacarídeos sulfatados e trifluoperazina

Abstract

Microssomas de cérebro de ratos acumulam Ca2+ contra-gradiente através da hidrólise do ATP. O transporte de Ca2+ não é modulado pelos cátions monovalentes K+, Na+ ou Li+. A captação de Ca2+ e a atividade Ca2+ ATPásica dos microssomas foram inibidas pelos polissacarídeos sulfatados: heparina, condroitim fucosilado e sulfatado, dextran sulfato 8.000 e dextran sulfato 500.000. O IC50 (concentração de inibidor necessária para inibir 50% da captação ou atividade ATPásica) destes polissacarídeos ficou entre 0.5 à 8.0 ~Lg/ mi. A inibição foi antagonizada por KCI e por NaCI, sendo o LiCI inefetivo. Em conseqüência, o transporte de ca2+ pelos microssomas cerebrais, que na ausência de polissacarídeos sulfatados não era modulado pelos cátions monovalentes, tornou-se extremamente sensível a presença destes cátions. A trifluoperazina em doses relativamente baixas (até 80 μM) estimulou o transporte de Ca2+ em cérebro, mas inibiu este processo quando testada em concentrações mais elevadas. Em músculo e plaquetas a trifluoperazina apenas inibiu o transporte de Ca2+. A Ca2+ ATPase de todas as preparações foi inibida por trifluoperazina, embora a concentração necessária para causar tal efeito tenha sido maior do que aquela que inibia o transporte de Ca2+. O efluxo passivo (medido na ausência de substratos e ligantes da Ca2+ ATPase) foi estimulado pela trifluoperazina (50 μM a 150 μM), sendo este efeito potencializado pela heparina (10 μ/ml), mesmo na presença de KCI. Propussemos que a modulação da isoforma de Ca2+ ATPase expressa em cérebro por polissacarídeos sulfatados e por trifluoperazina é distinta daquela observada em vesículas derivadas de músculo esquelético de contração rápida e de plaquetas. No segundo artigo investigamos o efeito dos polissacarídeos sulfatados e do pH sobre o transporte de Ca2+ + em microssomas de cérebro, especialmente sobre o efluxo de Ca2+ de vesículas pré-carregadas. A adição de polissacarídeos sulfatados, após o transporte de Ca2+ ter atingido o estado estacionário, promoveu uma liberação do Ca2+ previamente captado. Esta liberação foi antagonizada pelo K+. Todavia (à pH 7.0) , a adição de heparina (até 100 μg/ml ) , dextran suIfato 8,000 (até 8 μg/ml) e chodroitim fucosilado sulfatado (até 10 μg/ml) não estimulou o efluxo unidirecional de Ca2+ (medido na ausência de substratos e ligantes da Ca2+ ATPase) medido em microsomas de cérebro. O efluxo unidirecional de Ca2+ medido na presença de EGTA e à pH 6.0 foi cerca de 2 vezes maior do que o observado a pH 7.0. Em pH ácido (6.0) os polissacarídeos sulfatados promoveram um aumento considerável no efluxo unidirecional de Ca2+. O dextran sulfato 500.000 estimulou o efluxo unidirecional de Ca2+ independentemente do pH do meio. O KCI antagonizou o efeito de todos os polissacarídeos sulfatados testados. A potência inibitória da heparina, dextran sulfato 8,000 e do condroitim fucosilado sobre o transporte de Ca2+ por microsomas cerebrais aumentou com a diminuição do pH do meio. De modo similar ao observado na experiências de efluxo unidirecional, o efeito do dextran sulfato 500. 000 não foi afetado pelo pH do meio.

Rat brain microsomes accumulate ca2+ at the expense of A TP hydrolysis. The rate of transport is not modulated by the monovalent cations K+. Na+ or Li+. Both the Ca2+ uptake and the Ca2+ dependent ATPase activity of microsomes are inhibited by the sulfated polysaccharides heparin, fucosylated chondroitin sulfate and dextran sulfate. Half maximal inhibition is observed with sulfated polysaccharide concentrations ranging from 0.5 to 8.0 μg/ mi. The inhibition is antagonized by KCI and NaCl but not by LiCl. As a result, Ca2+ transport by the native vesicles which in the absence of polysaccharides is not modulated by monovalent cations becomes highly sensitive to these ions. Trifluoperazine has a dual effect on the Ca2+ pump of brain microsomes. At low concentrations (20 to 80 μM) it stimulates the rate of Ca2+ influx and at concentrations higher than 100 μM it inhibits both the Ca2+ uptake and the ATPase activity. The activation observed at low trifluoperazine concentrations is specific for the brain Ca2+ ATPase: For the Ca2+ ATPases found in blood platelets and in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle, trifluoperazine causes only a concentration-dependent inhibition of Ca2+ uptake. Passive Ca2+ efflux from brain microsomes preloaded with Ca2+ is increased by trifluoperazine (50 μM to 150 μM), and this effect is potentiated by heparin (10 μg/ml), even in the presence of KCI. lt is proposed that the Ca2+ ATPase isoform from brain microsomes is modulated differently by polysaccharides and trifluoperazine when compared to skeletal muscle and platelet isoforms. Rat brain microsomes accumulate Ca2+ at the expense of ATP hydrolysis. Addition of sulfated polysaccharides to microsomes after a steady state of Ca2+ uptake was reached caused a significant Ca2+ release that was antagonized by K+. However, at neutral pH , heparin (up to 100 μg / m 1), dextran suIfate 8,000 (up to 8 μg /ml) and fucosylated chodroitin sulfate (up to 10 μg/ml) did not increase unidirectional Ca2+ efflux (Ca2+ efflux measured in the absence of Ca2+ ATPase substrates and ligands) in brain microsomes. The unidirectional Ca2+ efflux in the presence of EGTA increased about 2- fold when pH was decreased from 7.0 to 6.0. ln contrast to that observed at pH 7.0, at acid pH, all the sulfated polysaccharides tested increased the Ca2+ efflux rate. Dextran sulfate 500,000 increased unidirectional Ca2+ efflux, regardless the pH of the medium. Potassium ion antagonized the effect of all sulfated polysaccharides tested. The inhibitory potency of heparin, dextran sulfate 8,000 and branched and fucosylated chondroitin sulfate increase as pH of the medium is acidified. As for the case of unidirectional Ca2+ efflux, the inhibitory potency of dextran sulfate 500,000 was not affected by medium pH. These results indicate that sulfated polysaccharides inhibit Ca2+ transport and promote unidirectional Ca2+ efflux with higher potency at an acidic pH.