Excitotoxicidade glutamatérgica em modelos experimentais de doenças cerebrais : efeitos neuroprotetores das purinas derivadas da guanina e inosina

Abstract

A hiper estimulação do sistema glutamatérgico (excitotoxicidade), é um evento tóxico para o sistema nervoso central (SNC) e está envolvida em diversas doenças cerebrais agudas e crônicas. O glutamato, principal neurotransmissor excitatório do SNC, exerce suas funções através da ativação de seus receptores. A modulação da neurotransmissão glutamatérgica envolve a retirada do glutamato da fenda sináptica por transportadores específicos. Diversos estudos têm demonstrado que as purinas derivadas da guanina e a inosina apresentam efeitos neuroprotetores em modelos experimentais de doenças cerebrais relacionadas com a excitotoxicidade. Nesta tese, nós demonstramos que a captação de glutamato em fatias de várias estruturas cerebrais é diferente em ratas que apresentam comportamento tipo depressivo quando comparadas com ratas normais. Ou seja, nas ratas com comportamento tipo-depressivo houve um aumento inicial da captação de glutamato hipocampal e uma diminuição gradual após as 24 h que persiste até 21 dias. Nas ratas normais não houve alterações na captação de glutamato. O hipocampo foi a estrutura cerebral mais sensível ao comportamento de depressão. Alèm disso, evidenciamos o potencial neuroprotetor do GMP, da guanosina e da inosina em diferentes modelos experimentais de doenças cerebrais. A administração sistêmica de GMP induziu um comportamento ansiolítico em protocolos clássicos para avaliar drogas com potencial ansiolítico/ansiogênico em ratos. A administração oral crônica de GMP em camundongos aumentou a resistência do córtex cerebral a um insulto isquêmico ex vivo por privação de oxigênio e glicose. Esse efeito neuroprotetor foi correlacionado com modulações do sistema glutamatérgico. Ou seja, a administração de GMP foi capaz de diminuir o imunoconteúdo de algumas subunidades de receptores e de alguns subtipos de transportadores glutamatérgicos. Isto potencialmente pode estar relacionado ao efeito neuroprotetor ocasionado pela diminuição da sinalização e da fonte de glutamato, respectivamente, durante o insulo isquêmico. Além disso, verificamos que a administração intracerebroventricular de inosina exerceu efeito anticonvulsivante em camundongos frente a convulsões induzidas por ácido quinolínico, um potente agonista glutamatérgico. Este efeito foi independente dos receptores benzodiazepínicos. Avaliamos também o efeito do tratamento oral crônico com guanosina frente ao prejuízo cognitivo e dano hipocampal em ratos submetidos à hipoperfusão cerebral crônica. O tratamento com guanosina não foi capaz de prevenir o prejuízo cognitivo, porém nenhum animal tratado apresentou dano hipocampal. Por fim, investigamos o possível sítio de união da guanosina à membrana plasmática cerebral em ratos. Verificamos que as preparações enriquecidas em membrana plasmáticas, comumente utilizadas em protocolos de união, apresentam níveis significativos de guanosina endógena. Entretanto estes níveis elevados de guanosina endógena podem mascarar os níveis de união da guanosina. Por isso apresentamos uma metodologia capaz de diminuir os níveis de guanosina endógena, detectando assim um maior nível de união da guanosina nas preparações enriquecidas em membrana plasmática. Por fim, apresentamos alguns dados que mostram a necessidade de melhorar a purificação das preparações enriquecidas em membrana plasmática para evitar a contaminação com membrana mitocondrial. . De uma maneira geral, esta tese traz contribuições para um melhor entendimento das alterações do sistema glutamatérgico e o potencial neuroprotetor das purinas derivadas da guanina e da inosina em doenças cerebrais envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica.

The neurotoxicity caused by overstimulation of glutamatergic system is implicated in several acute and chronic brain diseases. Glutamate mediate the excitatory synaptic transmition in the brain by acting on the ionotropic and metabotropic glutamate receptors The uptake mechanisms performed by specific transporter proteins have an important role in modulate the glutamatergic neurotransmission. Several studies have shown that the guanine based-purines and inosine exhibit neuroprotective effects in experimental models of brain disorders caused by excitotoxicity. In this thesis, we showed that the glutamate uptake by different brain structures of female rats with depression-like behavior is different from the normal female rats. For example, in female rats with depression-like behavior there was an initial increase in the hippocampal glutamate uptake followed by a gradual decrease after 24h that persist up to 21 days compared to animals without depressive-like behavior.The hippocampus was the most sensitive brain structure related to this behavior. We also reported the neuroprotective potential effect of GMP, guanosine, and inosine in different experimental models of brain diseases. We showed that systemic administration of GMP induced an anxiolytic-like behavior in classic behavior protocols developed to evaluate potential anxyolityc/anxiogenic drugs in rats. We also demonstrated that an oral chronically administration of GMP in mice increased the resistance of the brain cortex to an ex vivo ischemic insult, the oxygen and glucose deprivation. This neuroprotective effect was correlated with changes in the brain cortical glutamatergic system. The GMP administration decreased the immunocontent of some glutamate receptors subunits and some subtypes of glutamate transporters. Those effects may be related to the neuroprotective effect by decreasing the signaling pathway and the source of glutamate, respectively, during an ischemia insult. Moreover, we reported that an intracerebroventricular administration of inosine caused an anticonvulsive effect in mice against seizures induced by quinolinic acid, a potent glutamate agonist. This effect was independent of benzodiazepines receptors. We also investigated the effect of an oral chronically treatment with guanosine against the cognitive impairment and the hippocampal damage observed in animal model of chronic cerebral hypoperfusion. The guanosine treatment did not prevent the cognitive impairment, however none of the animals treated with guanosine presented hippocampal damage. Finally, we investigated the guanosine binding site at the rat brain plasma membrane. We reported that the plasma membrane enriched preparations, commonly used in binding protocols, shows significant levels of endogenous guanosine. However, the increased levels of endogenous guanosine could mask the guanosine binding. For this reason we proposed a new methodology to decrease the endogenous guanosine in the plasma membrane enrich preparations to be able to detect the increase level of guanosine binding. Moreover, we presented some data that corroborate with the need of a better purify plasma membrane enrich preparations to avoid the contamination with mitochondrial membranes. Therefore, the work developed during this thesis contributes to a better understanding of alterations in the glutamatergic system and the neuroprotective potential of the guanine based purines and inosine in brain disorders related to glutamatergic excitotoxicity.