Investigação dos biomarcadores de inflamação e estresse oxidativo em pacientes portadores de mucopolissacaridoses tipo II e IVA e em modelo celular de mucopolissacaridose tipo II por edição gênica

Abstract

As mucopolissacaridoses são doenças lisossômicas de depósito, na qual os glicosaminoglicanos, ao invés de serem clivados dentro do lisossomo, são acumulados dentro dessa organela celular, devido a uma falha nessa rota enzimática. A Mucopolissacaridose IV é caracterizada pela deficiência da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase, acumulando queratan sulfato. Já a Mucopolissacaridose tipo II é caracterizada pela deficiência da enzima iduronato-2-sulfatase e acúmulo de heparan sulfato e dermatan sulfato. Esse acúmulo de glicosaminoglicanos leva a problemas secundários, como a ativação da cascata inflamatória, a produção de espécies reativas e disfunção mitocondrial. O objetivo geral deste projeto de pesquisa foi investigar os mecanismos de estresse oxidativo e inflamação em pacientes portadores de Mucopolissacaridose tipo II no momento do diagnóstico e após o transplante de células-tronco hematopoiéticas, em pacientes portadores de Mucopolissacaridose tipo IVA durante tratamento com terapia de reposição enzimática, bem como avaliar o efeito in vitro de antioxidantes (genisteína e coenzima Q 10) sobre parâmetros de estresse oxidativo e disfunção mitocondrial em modelo celular para Mucopolissacaridose tipo II. Os dados apresentados sobre pacientes com Mucopolissacaridose tipo II sugerem que os mesmos se encontram em estado de desequilíbro redox e pró-inflamatório, com aumento dos níveis de isoprostanos urinários, das interleucinas IL-1β e IL-17a e a tendência de aumento da IL-6. Além disso, os pacientes com Mucopolissacaridose tipo II pós- transplante de células-tronco hematopoiéticas demonstraram uma melhora nos parâmetros analisados, trazendo evidências de como esse tratamento pode ser benéfico para esses pacientes. Vale ressaltar que até o momento não havia sido descrito na literatura o aumento de IL-17a em pacientes com Mucopolissacaridose tipo II. Esse dado é pioneiro e extremamente relevante, visto que essa interleucina é considerada osteoclastogênica e esses pacientes apresentam deformações ósseas importantes. Relatamos pela primeira vez que não há aumento significativo da resposta inflamatória e estresse oxidativo/nitrosativo em pacientes com Mucopolissacaridose tipo IVA em tratamento prolongado com terapia de reposição enzimática. Isso demonstra um possível efeito protetor do tratamento em relação aos parâmetros estudados e a importância de iniciar o tratamento nos estágios iniciais da doença. Já em relação ao nosso estudo de modelo celular por edição gênica, foi demonstrado que o modelo celular heterozigoto composto nocaute para Mucopolissacaridose tipo II apresenta menos alterações nos parâmetros estudados, em comparação com o modelo celular homozigoto nocaute para Mucopolissacaridose tipo II. Isso evidencia que os modelos celulares podem caracterizar diferentes fenótipos, e que a genisteína demonstrou efeito protetor contra o aumento de espécies reativas de oxigênio. Este modelo celular pode ajudar a elucidar a fisiopatologia da Mucopolissacaridose tipo II, bem como demonstrar os benefícios da genisteína nesta doença.

Mucopolysaccharidoses are lysosomal storage diseases, as glycosaminoglycans, instead of being cleaved inside the lysosome, are accumulated within this cellular organelle, due to a failure in this enzymatic route. Mucopolysaccharidoses type IV is characterized by the deficiency of the enzyme N-acetylgalactosamine 6-sulfatase, accumulating keratan sulfate. Mucopolysaccharidoses type II is described by the deficiency of the enzyme iduronate-2-sulfatase and accumulation of heparan sulfate and dermatan sulfate. This accumulation of GAG leads to secondary problems, such as the activation of the inflammatory cascade, the production of reactive species and mitochondrial dysfunction. The aim of this research project was to investigate the mechanisms of oxidative stress and inflammation in patients with Mucopolysaccharidoses type II at the time of diagnosis and post-hematopoietic stem cell transplantation, in patients with Mucopolysaccharidoses type IVA during treatment with enzyme replacement therapy, as well as to evaluate the in vitro effect of different antioxidants (genistein, coenzyme q10) on parameters of oxidative stress and mitochondrial dysfunction in cellular models for Mucopolysaccharidoses type II. The data presented about Mucopolysaccharidoses type II patients showed that they are in redox imbalance and pro-inflammatory state, with an increase in the urinary isoprostane levels, increase interleukins IL-1β and IL-17a and a tendency towards an increase in IL-6. The Mucopolysaccharidoses type II patients post- hematopoietic stem cell transplantation showed an improvement in the analyzed parameters, bringing evidences on how this treatment can be beneficial to these patients. It is worth noting that until now, an increase in IL-17a in Mucopolysaccharidoses type II patients has not been described in the literature. This data is pioneering and extremely relevant, since this interleukin is considered osteoclastogenic and these patients present significant bone deformations. We reported for the first time that there is no significant increase in the inflammatory response and oxidative/nitrosative stress in patients with Mucopolysaccharidoses type IVA on prolonged treatment with enzyme replacement therapy. This shows the protective effect of treatment in relation to the parameters studied and the importance of initiating treatment in the early stages of the disease. In relation to our study of the cellular model by gene editing, it was demonstrated that the heterozygous Mucopolysaccharidoses type II knockout cellular model presents less alterations in the parameters studied, in comparison with the homozygous Mucopolysaccharidoses type II knockout cellular model. This indicate that the cellular models can characterize different phenotypes and that genistein showed a protective effect against increased reactive oxygen species. This cellular model may help to elucidate the pathophysiology of Mucopolysaccharidoses type II, as well as demonstrate the benefits of genistein in this disease.