Efeitos dos alcalóides harmina, harmalina, harmol, harmalol, harmano sobre a resposta proliferativa in vitro de linfócitos periféricos humanos estimulados por fitoemaglutinina

Abstract

Os alcalóides indólicos beta-carbolinas foram inicialmente descritos por Goebel em 1841 a partir da planta Peganum harmala. Estes alcalóides são conhecidos por apresentarem ações sobre o sistema nervoso central, inibindo a enzima monoamino oxidase, sobre o sistema cardiovascular, causando hipotensão e bradicardia e sobre o DNA, intercalando-se entre as bases que o compõem, o que explicaria a ação co-mutagênica e clastogênica dos mesmos. No presente estudo, foi investigada a influência de cinco alcalóides das beta-carbolinas (harmina, harmalina, harmol, harmalol e harmano) sobre a proliferação de linfócitos periféricos humanos estimulados com fitoemaglutinina (PHA), um teste in vitro para a determinação da imunocompetência celular. As células mononucleares (linfócitos) obtidas de sangue venoso periférico de voluntários hígidos foram cultivados no meio de cultura RPMI 1640 em micro placas de 96 poços com fundo plano a 37° C por 96 horas na presença de 5% de CO₂ em ar na presença de 1 % de fitoemaglutinina, 1O % de soro autólogo e de cada um dos alcalóides nas concentrações de 3 a 100 μg.ml⁻¹ , em alguns experimentos e na concentração de 50 μg.ml⁻¹ em outros. As culturas controles não continham nenhum alcalóide. O método de MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) foi utilizado para verificar a proliferação celular. Todos as cinco beta-carbolinas foram capazes de inibir a proliferação celular nas doses de 50 e 100 μg.ml⁻¹, enquanto o harmol também apresentou efeito imunossupressor nas doses de 25 μg.ml⁻¹ . Já o alcalóide utilizado como controle, a cafeína, não apresentou qualquer efeito sobre a reatividade linfocitária o que indica uma ação específica dos alcalóides da harmala. Quando os alcalóides foram adicionados em diferentes tempos a partir do início das culturas (O, 24, 48 e 72 horas) foi detectada uma atividade imunoregulatória variável sobre os linfócitos estimulados por fitoemaglutinina. Nenhum alcalóide causou inibição na proliferação após 72 horas do início das culturas, o que indica uma ação imunomoduladora nos estágios iniciais da cultura celular. Os alcalóides harmalol e harmano inibiram a proliferação somente no tempo 0 hora do início das culturas. A harmina mostrou-se a menos dependente de tempo, pois até 48 horas após o início das culturas causou inibição da proliferação linfocitária. Já o harmol e a harmalina apresentaram um mecanismo de ação intermediário, pois causaram inibição até 24 horas após o início das culturas. Todos os alcalóides das beta-carbolinas foram capazes de inibir a proliferação linfocitária quando pré-incubados por 4 horas e após retirados do meio de cultura, refletindo a ação destes nos estágios precoces da proliferação linfocitária. A harmina e a harmalina apresentaram a maior inibição da resposta linfocitária quando se mantiveram presentes durante todo o período da cultura ou quando foram adicionados após a pré-incubação. O mesmo ocorreu para os alcalóides harmol, harmalol e harmano quando presentes durante toda a cultura. Eles apresentaram efeito menor quando adicionados somente após a pré-incubação. Os estudos com citometria de fluxo confirmaram o efeito inibitório dos alcalóides indicando que sua ação está dirigida para os linfócitos (CD3+).

The alkaloids beta-carbolines were firstly described by Goebel in 1841 in Peganum harmala. These alkaloids present effects on the central nervous system, inhibit the moamine oxidase enzyme, on the cardiovascular system, causing hypotension and bradycardia and on DNA, forming DNA adducts. ln the present study we investigated five alkaloids of the beta-carbolines family (harman, harmine, harmaline, harmol and harmalol) and the alkaloid caffeine on the proliferation of lymphocytes stimulated by fitohemaglutin (PHA). A recognize in vitro for cellular immune response. Mononuclear cells (lymphocytes) obtained from venous peripheral blood from healthy volunteers were cultivated in RPMI1640 in bottom-flat 96 well microplates at 37° C for 96 h. ln the presence of 5% CO₂ in air, 1% PHA, 10% autologous serum and each one of the alkaloids in concentrations ranging from 3 to 100 μg/ml⁻¹ ln some experiments on 50 μg/ml⁻¹ in others cultures did not contain alkaloids. The MTT (3-[ 4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) method was used to measure cellular proliferation. Ali five alkaloids from the beta-carbolines family were able to inhibit lymphocyte proliferation in doses on 50 μg/ml⁻¹ and 100 μg/ml⁻¹ while harmol was also immunosuppressive in doses at 25 μg/ml⁻¹. On the other hand, caffeine did not affect lymphocyte proliferation. When the alkaloids were added at different periods after the beginning of cultures (0, 24, 48 and 72 hours) they showed a variable immunosuppressive activity on PHA-treated lymphocytes. None causes inhibition after 72 hours of culture, indicating a early action on cultures. Harmalol and harmano suppress the proliferation only at time 0. Harmine inhibit until 48 h after the beginning of cultures. Harmol and harmane had an intermediate action, since they causes am inhibition until 24 h of culture. All beta-carbolines were able to suppress lymphocyte proliferation when pre-incubated for 4 hours, reflecting an early action on lymphocyte reactivity. Harmine and harmaline presented the greater inhibition on lymphocyte proliferation when were present during the whole culture (pre-incubation and incubation) when were add after pre-incubation the same occurred for harmol, harmalol and harman. When present during the whole culture. However, these alkaloids had a lesser effect when supplemented only after the pre-incubation. The studies utilizing the flow cytometry confirmed the inhibition effects of these alkaloids, indicating that their action is directed to lymphocytes (CD3+).